免疫分析技術在“新型瘦肉精”殘留檢測中的應用

王耀，曹金博，陳曦，李燕虹，陳秀金，李兆周，鄧瑞廣，胡驍飛*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽，471023) 2(河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州，450002)

“瘦肉精”是指能夠促進肌肉發(fā)育和脂肪分解，提高胴體瘦肉比率的一類藥物的俗稱，屬于腎上腺素受體激動劑類藥物[1]。傳統(tǒng)的“瘦肉精”藥物包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等，臨床上主要用于治療支氣管疾病[2]。該藥物大量使用可促進動物體內(nèi)脂肪代謝，提高合成速率，增加瘦肉率，因此常被非法用作獸藥和添加在飼料中，但長期食用“瘦肉精”類藥物殘留的動物性食品會引起心悸、頭暈、乏力等中毒癥狀[3]。因此，農(nóng)業(yè)部于2010年12月27日發(fā)布的[1519]號公告明確指出，禁止在飼料和動物飲水中添加以上物質。但從2010年開始，農(nóng)業(yè)部以及多個省市在飼料安全預警監(jiān)測工作中發(fā)現(xiàn)存在非法添加使用“新型瘦肉精”的情況，如苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂定等藥物[4]，不法分子為逃避監(jiān)控，利用其同樣具有腎上腺素受體激動劑效應，來降低養(yǎng)殖成本，提高禽畜瘦肉率。因此，動物性食品中“新型瘦肉精”殘留的快速監(jiān)控尤為必要，該類藥物的快速檢測方法研究已成為必然趨勢并且逐漸成為動物性食品安全研究領域的熱點之一。免疫分析技術以抗原抗體間的特異性反應為基礎，利用分子標記物(如放射性同位素、熒光素、酶、納米發(fā)光材料)作為抗原或抗體的示蹤物，并借助相應儀器檢測，從而顯著提高檢測的特異性和靈敏度，是快速檢測方法的主要技術支撐[5]。本文對免疫分析技術在“新型瘦肉精”殘留檢測中的應用進行綜述，并對其發(fā)展方向進行展望，旨在為建立簡單快速、靈敏特異的“新型瘦肉精”檢測方法提供參考。

1 “新型瘦肉精”概述

“新型瘦肉精”主要相對于鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等在畜禽屠宰過程中主要監(jiān)控的“傳統(tǒng)瘦肉精”而言，具體包括苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂定、巴氯芬等藥物。苯乙醇胺A(phenylethanolamine A)臨床上用來治療哮喘等呼吸道疾病，能有效地緩解支氣管痙攣，舒張支氣管等作用[6]。賽庚啶(cyproheptadine)屬于三環(huán)類抗組胺藥物，具有顯著的中樞神經(jīng)抑制以及抗膽堿作用，臨床上可用于治療濕疹、蕁麻疹、皮膚瘙癢等皮膚黏膜的過敏性疾病，也可治療小兒喘息性支氣管炎、瘧疾小兒偏頭痛等[7]?？蓸范?clonidine)能抑制中樞神經(jīng)，臨床上主要用于治療高血壓、高血壓急癥、偏頭痛等癥狀[8]。巴氯芬(baclofen)在臨床上則主要用于治療骨骼肌松馳，緩解痙攣及外傷等[9]。

圖1 主要新型瘦肉精結構式Fig.1 Structure of main new types of lean meat powder

雖然幾種“新型瘦肉精”藥物的結構并不相似(如圖1所示)，但卻均具有腎上腺素受體激動劑效應，能夠起到營養(yǎng)再分配作用，降低飼料消耗，提高動物生長速率，改善胴體品質。這些藥物也存在一定的毒性作用，如賽庚啶中毒癥狀經(jīng)常表現(xiàn)為嗜睡、共濟失調(diào)、肌肉抽搐等[10]；可樂定在體內(nèi)濃度過高則引起口干、心動過緩、嗜睡等癥狀[11-12]；巴氯芬的不良反應則表現(xiàn)為嗜睡、眩暈、抑郁、嘔吐、腹瀉、頭疼等[13]。如果長期食用含有這些藥物殘留的動物性食品，將導致藥物在體內(nèi)蓄積，對健康產(chǎn)生危害。因此，研發(fā)快速檢測技術對動物性食品中“新型瘦肉精”藥物殘留進行高效監(jiān)控就顯得尤為必要。

2 免疫分析技術

目前，針對動物性食品中“瘦肉精”的確證檢測方法多以高效液相色譜法[14-15]、氣相色譜-質譜法[16-17]為主。色譜技術選擇性強、分辨率好、靈敏度高、假陽性率低，但檢測過程比較繁瑣、費用高、耗時長，儀器要求高，受檢測地點等因素限制，不能很好地滿足大批量樣品的快速篩查[18]。近年來，免疫分析技術在食品安全檢測領域發(fā)展迅速，根據(jù)抗原或抗體標記物質的不同，已形成了放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、膠體金免疫分析、化學發(fā)光免疫分析等方法的分析體系，這些方法利用高親和力抗體對抗原進行特異性識別，通過特定標記物質作為反應放大指示，借助相應儀器實現(xiàn)靈敏特異檢測。由于免疫分析技術操作簡單，對儀器設備的要求不高，費用低，適用于大批量樣品的快速初步分析[19]。免疫分析技術已經(jīng)在“傳統(tǒng)瘦肉精”的快速檢測中成熟應用[20]，而針對“新型瘦肉精”的免疫學分析技術較為有限，主要可以分為以下三個方面。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)是一種經(jīng)典的高靈敏酶免疫分析方法，近年來，ELISA發(fā)展迅速且技術逐漸成熟，已經(jīng)成為食品檢測領域主要的免疫分析方法之一，該方法簡單快速、靈敏度高，成本較低且不需大型儀器設備，適合大批量樣品的快速篩查[21]。該方法用于小分子危害物的檢測時，多采用間接競爭模式，如圖2所示。首先將包被抗原固定于固相載體，檢測時將樣品(含游離抗原)和抗體(一抗)混合并與固相載體表面的抗原反應，然后洗滌除去游離成分，加入酶標二抗與一抗進行反應，再次洗滌去除游離成分后加入酶反應底物引發(fā)顯色反應，最后終止反應根據(jù)顯色程度進行定量或定性分析[22]。

圖2 間接競爭ELISA原理圖Fig.2 Schematic diagram of indirect competitive ELISA

目前已經(jīng)初步用于一些“新型瘦肉精”藥物的快速檢測。LI等[23]基于單克隆抗體建立了一種快速檢測豬肉中苯乙醇胺A的間接競爭ELISA方法，半數(shù)抑制濃度(IC50)為6.25 ng/mL，檢測限為0.19 ng/mL，回收率為103.4%，能夠快速、準確檢測出肉樣中苯乙醇胺A殘留。WANG等[24]開發(fā)了一種更為靈敏的間接競爭ELISA用于檢測屠宰后禽畜肉樣中的苯乙醇胺A殘留，該方法IC50為0.32 ng/mL，檢測限低于0.08 μg/kg，但其回收率范圍較寬，為79.6%～112.6%。黃士新等[25]研發(fā)了一種快速測定動物尿液中賽庚啶殘留的ELISA試劑盒，該試劑盒為間接競爭模式，IC50為0.316 μg/L，檢測限為0.158 μg/L，回收率為80%～110%。李丹妮等[26]同樣基于間接競爭ELISA研發(fā)了一種可樂定ELISA快速檢測試劑盒，IC50為0.675 ng/mL，檢測限為0.2 ng/mL，回收率為81%～109%，可用于動物尿樣、血清和組織中的可樂定殘留檢測。

2.2 膠體金免疫層析試紙

膠體金免疫層析法是膠體金標記技術和抗原抗體的特異性反應相結合的一種免疫檢測技術[27]?；谠摲椒ńM裝的試紙主要由樣品墊、結合墊、層析膜(包括檢測線和質控線)、底板、吸水墊組成，結構如圖3所示，用于檢測小分子物質時，通常采用競爭模式[28]，該模式的結合墊噴點膠體金標記的抗體，檢測限線噴點小分子偶聯(lián)抗原，質控線噴點二抗。

圖3 膠體金免疫層析試紙結構圖Fig.3 Structure diagram of immunochromatographic strip

檢測時首先將樣液滴加在樣品墊上或將樣品墊插入樣液，樣液將與金標抗體一同向前移動，當樣品中沒有抗原時，檢測線就會結合金標抗體而顯色，當樣品中存在抗原時，金標抗體就會先與樣品中抗原結合，從而使檢測線結合的抗體量減少，顯色變?nèi)?，最終通過顯色強弱間接對樣品中抗原進行定性或定量分析。膠體金免疫層析試紙靈敏度高、對操作人員要求低，且不需要昂貴的儀器設備，已用于克倫特羅等傳統(tǒng)瘦肉精的快速檢測[29]，也是目前動物衛(wèi)生監(jiān)督部門對于“瘦肉精”藥物實施快速監(jiān)控的主要手段，而且與ELISA相比，可實現(xiàn)多殘留檢測[30]。聶雯瑩等[31]基于競爭原理，利用單克隆抗體建立了苯乙醇胺A膠體金免疫層析快速檢測方法，試紙檢測限為5 μg/L， 可快速、準確檢測出動物尿液中苯乙醇胺A殘留，無需樣品前處理，且與ELISA測定結果沒有差異。DAI等[32]同樣利用單克隆抗體研制免疫層析試紙用于豬尿中的苯乙醇胺A的檢測，該試紙?zhí)禺愋愿鼜?、靈敏度更高，檢測限為0.188 ng/mL。而對于其他“新型瘦肉精”，目前仍未有此類方法的研究及試紙產(chǎn)品的生產(chǎn)。

2.3 電化學發(fā)光免疫傳感器

電化學發(fā)光免疫傳感檢測是將免疫技術和電化學發(fā)光檢測技術相結合的一種新的標記免疫方法。它利用電化學發(fā)光反應試劑標記抗原或抗體，然后與待測物發(fā)生一系列的免疫反應，最后利用免疫反應前后電化學發(fā)光信號的改變，對抗體或抗原進行分析。具有特異性強、靈敏度高、簡單、快速、無放射污染、檢測限低等優(yōu)點[33]。與膠體金免疫層析法相比，其表現(xiàn)更加直觀，并可進行定量分析，已廣泛應用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、藥物分析等領域[34-35]。濟南大學張勇等基于金銀納米棒-殼聚糖復合納米功能材料發(fā)明了一種無標記電化學發(fā)光免疫傳感器[36]，用于檢測動物性食品中苯乙醇胺A等多種“瘦肉精”藥物殘留，結果相對偏差(RSD)小于3.3%，回收率為93.5%～105%，靈敏度高、特異性強、結果準確。湯慶會[37]則以L-半胱氨酸為穩(wěn)定劑，在水相中合成CdSe量子點，并利用其構建了一種超靈敏的量子點基電化學發(fā)光免疫傳感器對苯乙醇胺A(PA)殘留進行了檢測，原理如圖4所示，該方法檢測線為0.015 ng/mL，電化學發(fā)光強度與苯乙醇胺A濃度在0.05～1 000 ng/mL成線性關系，線性相關系數(shù)為0.997 6， 可定量檢測樣品中苯乙醇胺A含量。

圖4 電化學發(fā)光免疫傳感器原理圖Fig.4 Schematic diagram of electroche milumine scence immunosensor

3 小結

綜上所述，“新型瘦肉精”的出現(xiàn)使動物性食品安全出現(xiàn)了新的隱患，其殘留檢測研究已成為動物性食品安全監(jiān)控的重要技術支撐。在現(xiàn)有的檢測技術中，靈敏度高、選擇性強的驗證檢測方法已不能滿足實際現(xiàn)場監(jiān)控的需要。相比之下，免疫分析技術在檢測效率方面具有一定的優(yōu)勢，但目前在“新型瘦肉精”檢測中應用較少，仍有較大的發(fā)展空間?，F(xiàn)有針對“新型瘦肉精”的免疫檢測方法主要存在以下3個方面的問題，(1)所檢測的藥物種類偏少，大多數(shù)方法主要針對苯乙醇胺A進行檢測，而對于其他“新型瘦肉精”藥物，甚至對于未被列入國家禁用藥物名單的受體激動劑藥物則缺乏相關研究；(2)免疫分析方法檢測效率高，但相對于其他檢測方法，容易出現(xiàn)假陰性與假陽性結果，目前僅適用于大量樣品的快速篩查，因此在高特異性抗體制備及定量檢測方法研究方面仍需加強；(3)對于方法的研究仍存在一定的局限性，一些在小分子污染物檢測中已廣泛應用的標記材料和技術仍缺乏報道，以及在此基礎上發(fā)展起來熒光偏振免疫檢測、時間分辨免疫檢測、量子點發(fā)光免疫檢測等高靈敏方法也缺乏研究。因此，隨著動物性食品安全監(jiān)控體系的完善，免疫分析技術的不斷深入研究將為“新型瘦肉精”的快速高效篩查提供多樣化、廣覆蓋的檢測手段，以滿足不同層次的需求，同時也將為保障食品安全提供更好的技術支撐。