基于Spyligase技術的禽流感血凝素H5HA10多聚體抗原的高效制備

賈 賓,陳慧心,韓瑩倩,郭玉堃,邵科宇,郭豫杰

(河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院/農業(yè)部 動物生化與營養(yǎng)重點實驗室,河南 鄭州 450002)

禽流感病毒(avian influenza virus)屬于正粘病毒科,為負鏈單股RNA病毒,含有8個節(jié)段[1]。流感病毒粒子表面有兩種蛋白,分別為血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經氨酸酶(Neuramindase, NA)。血凝素是流感病毒囊膜纖突的主要成分,為一種糖蛋白,在病毒吸附及穿膜的過程中起關鍵作用；由于HA具有較高的變異率,因此它是引發(fā)流感病毒發(fā)生抗原變異的主要因素[2]。目前禽流感免疫主要通過傳統(tǒng)的滅活單價苗、多聯(lián)苗或者類毒素疫苗而實現(xiàn),這些傳統(tǒng)疫苗雖然能夠誘導動物產生一定的保護性抗體,但是它們存在安全性不高、穩(wěn)定性差、免疫后副作用大等缺點[3-4]?；蚬こ虂唵挝欢鄡r疫苗含有產生保護性免疫應答所必需的有效免疫成分,同時去除了與免疫無關的成分,因而相對于傳統(tǒng)疫苗而言其安全性、穩(wěn)定性更好,而且消除了傳統(tǒng)疫苗成分中熱原、變應原等反應原,很好地解決了傳統(tǒng)疫苗免疫后動物出現(xiàn)的副作用與炎性刺激問題[5]。因此,開發(fā)一種能夠預防禽流感的基因工程亞單位疫苗成為禽流感病防控技術中迫切需要解決的問題[6]。

CnaB2是釀膿鏈球菌纖維聯(lián)接蛋白黏附蛋白FbaB的一個結構域,是細菌侵入人體的必需結構[7]。Mark Howarth研究團隊從CnaB2中分離了N-末端帶有Lys31、C-末端帶有Asp117的能夠進行自發(fā)共價結合的 SpyTag/SpyCatcher,該反應可以在短時間內自發(fā)進行[8-10]。基于此開發(fā)了一種新的蛋白質連接技術——Spyligase技術?；谌碌腟pyligase蛋白質連接技術, Liu等開發(fā)出一種用于人造疫苗的合成新方法,該方法簡單易行,在對蛋白進行最小化修飾下,抗原蛋白可以形成環(huán)化單體、二聚體甚至多聚體,研究表明多聚體的形成可以增強疫苗的免疫效果[11]。目前在大腸桿菌系統(tǒng)表達HA蛋白方面的報道并不少,但是將環(huán)化技術應用到HA蛋白的報道還沒有。本研究利用Spyligase技術對禽流感H5亞型HA蛋白進行了改造,并利用DNA重組技術在目的基因序列的兩端分別加上SpyTag和KTag序列,成功構建了含9種促溶標簽的Spy-H5HA10重組蛋白表達載體和Spyligase重組蛋白表達載體；經用IPTG誘導表達,純化目的蛋白,體外環(huán)化驗證,在PCT緩沖液中成功獲得了Spy-H5HA10重組蛋白的多聚體混合物。本實驗驗證了Spyligase技術在體外可以指導H5HA10蛋白形成多聚體,這為后續(xù)將H5HA10多聚體抗原應用于基因工程疫苗的研究奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞、表達載體pET-21b均由本實驗室提供;帶有不同融合標簽的10種質粒pEX-His6-ArsC-TEV-LIC、pEX-His6-Cherry-TEV-LIC、pEX-His6-PAS200-TEV-LIC、pEX-His6-XTEN-TEV-LIC、pEX-His6-PEAT-TEV-LIC、pEX-SiTag3-SUMO-TEV-LIC、pEX-SiTag3-MBP-TEV-LIC、pEX-SiTag3-PAS200-TEV-LIC、pEX-SiTag3-XTEN-TEV-LIC和pEX-SiTag3-ArsC-TEV-LIC為本實驗室前期構建并保存;限制性內切酶BamH I、Xho I、Nde I和T4 DNA連接酶(TaKaRa);DNA分子質量標準DL2000、DL5000(TaKaRa); Agarose(GENVIEN公司);考馬斯亮藍R-250、吐溫、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG) (北京鼎國昌盛生物技術公司); Ni-NTA Agarose (Qiagen)購自天馳生物科技有限公司; SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工);檸檬酸、氧化三甲胺(TMAO)(Sigma)。

1.2 Spy-H5HA10基因的設計與合成

1.3 高效可溶性融合表達載體的構建

將本實驗室保存的含有不同促溶標簽的質粒pEX-His6-ArsC-TEV-LIC、pEX-His6-PAS200-TEV-LIC、pEX-His6-XTEN-TEV-LIC、pEX-His6-PEAT-TEV-LIC、pEX-SiTag3-SUMO-TEV-LIC、pEX-SiTag3-MBP-TEV-LIC、pEX-SiTag3-PAS200-TEV-LIC、pEX-SiTag3-XTEN-TEV-LIC和pEX-SiTag3-ArsC-TEV-LIC分別用BamH I和Xho I進行雙酶切,經1.0%瓊脂糖凝膠電泳,用柱式DNA膠回收試劑盒回收,產物于-20 ℃保存。目的基因Spy-H5HA10經PCR擴增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,用柱式DNA膠回收試劑盒切膠回收,與pMD19-T載體連接,連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a,涂布于Amp(100 mg/mL)固體培養(yǎng)基,挑取單克隆進行菌液PCR鑒定并送測序；鑒定成功后提取質粒用限制性內切酶Xho I和BamH I酶切,酶切產物分別與上述回收的9種載體片段連接,于16 ℃過夜,轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),挑取陽性克隆測序,將測序正確的9種Spy-H5HA10重組載體保存菌種。目的基因Spyligase和pEX-His6-Cherry-TEV-LIC載體分別經BamH I和Xho I雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段,T4 DNA連接酶連接,構建新的重組載體pEX-His6-Cherry-TEV-Spyligase,測序正確后保存菌種。目的基因在載體中的連接順序如圖1所示。

圖1 目的基因在重組表達載體中的連接順序

1.4 蛋白表達與可溶性分析

將含9種Spy-H5HA10重組載體和pEX-His6-Cherry-TEV-Spyligase重組載體的E.coliBL21甘油菌活化后誘導表達,并對IPTG的濃度(0.2、0.5、0.8 mmol/L)及誘導溫度(18、25 ℃)進行優(yōu)化。誘導結束后于4 ℃、9000 r/min離心30 min,分別收集上清和沉淀,經SDS-PAGE凝膠電泳,檢測重組蛋白的表達。使用ImageJ進行灰度掃描,分析重組蛋白的可溶性表達水平,篩選出最佳誘導條件。

1.5 蛋白的純化

將陽性菌液接種至1L LB(Amp 100 mg/mL)液體培養(yǎng)基中,擴大培養(yǎng),當OD600為0.6～0.8時,加入IPTG,在25 ℃下誘導表達12 h后,于4 ℃、8000 r/min離心10 min，收集菌體,用平衡緩沖液(1 mol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、5 mmol/L咪唑)重懸沉淀,低溫超聲破碎菌體；將破碎后的混合液在4 ℃下以12000 r/min離心30 min,收集上清,加到預處理的Ni-NTA填料中,低溫結合1 h,分別用洗雜緩沖液(1 mol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、5/10/15/20/25/50/75/100/250/300 mmol/L咪唑)洗脫雜蛋白,篩選洗雜緩沖液后,加大洗脫體積,最后用洗脫緩沖液(1 mol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L咪唑)洗脫,收集洗脫的融合蛋白,用超濾管和脫鹽柱脫鹽濃縮,再用BCA蛋白定量試劑盒定量,于-80 ℃保存。

1.6 Spy-H5HA10多聚體的形成

將脫鹽處理后定量的蛋白按照1∶3到3∶1之間的比例設置濃度梯度進行加樣處理,如表1所示,在4 ℃ PCT緩沖液[12]中反應,每6 h取樣1次,于99 ℃變性10 min,經SDS-PAGE分析,確定最佳反應條件。

表1 Spyligase與H5HA10反應的比例

注:1、2、11、12孔為對照組。

2 結果與分析

2.1 載體的酶切

經BamH I和Xho I雙酶切，獲得含有9種促溶標簽的線性載體,電泳顯示目的片段大小與預期一致(圖2A); pET21b-His6-Cherry載體由BamH I和Xho I雙酶切線性化,電泳顯示獲得了含有His6-Cherry可溶性標簽的片段,大小與預期相符(圖2B)。

M： DL 5000 DNA分子質量標準;1～9： pET21b-His-ArsC、pET21b-His-PAS200、pET21b-His-XTEN、pET21b-His-PEAT、pET21b-SiTag3-SUMO、pET21b-SiTag3-MBP、pET21b-SiTag3-PAS200、pET21b-SiTag3-XTEN和pET21b-SiTag3-ArsC;11～13： pET21b-His6-Cherry。

圖2載體的酶切結果

2.2 目的基因Spy-H5HA10和Spyligase的獲得

測序正確的pMD19-T-Spy-H5HA10重組質粒通過BamH I和Xho I雙酶切獲得目的基因Spy-H5HA10,其片段大小為534 bp,瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示與預期大小一致(圖3A);含有Spyligase序列的重組質粒,經BamH I和Xho I雙酶切得到Spyligase基因片段,該片段大小為333 bp,瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示與預期大小一致(圖3B)。

M： DL 5000 DNA分子質量標準;1～8： Spy-H5HA10經BamH I和Xho I雙酶切獲得目的基因片段;9～11： Spyligase經BamH I和Xho I雙酶切獲得目的基因片段。

圖3BamHI和XhoI雙酶切獲得的目的片段

2.3 重組質粒的鑒定

將9種含有目的基因Spy-H5HA10的重組質粒經Xho I 和Nde I雙酶切,片段大小分別為1176、1176、966、1434、1191、1434、1713、1089、1089 bp,瓊脂糖凝膠電泳結果顯示與預期片段大小相符(圖4A)；同時測序結果顯示9種重組質粒序列無堿基突變,重組質粒構建成功。含有Spyligase目的基因的融合標簽重組質粒經Xho I 和Nde I雙酶切,電泳顯示在630 bp處有與預期片段大小相符的條帶(圖4B),測序結果顯示重組質粒pET21b-His6-Cherry-Spyligase構建成功。

1～9： pET21b-His-PAS200-H5HA10、pET21b-SiTag3-PAS200-H5HA10、pET21b-SiTag3-SUMO-H5HA10、pET21b-SiTag3-XTEN-H5HA10、pET21b-His-PEAT-H5HA10、pET21b-His-XTEN-H5HA10、pET21b-SiTag3-MBP-H5HA10、pET21b-His-ArsC-H5HA10、pET21b-SiTag3-AesC-H5HA10;10～12： pET21b-His6-Cherry-Spyligase。

圖49種重組質粒NdeI和XhoI雙酶切鑒定結果

2.4 含有目的基因Spy-H5HA10的9種重組蛋白的可溶性分析

SDS-PAGE凝膠電泳檢測顯示, pET21b-His-PAS200-H5HA10和pET21b-SiTag3-PAS200-H5HA10(圖5A、圖5B)條帶大小與預期不符；其余7種融合標簽重組載體的電泳結果顯示在35.42、52.58、43.67、52.58、62.81、39.93、39.93 kDa處有與預期大小相一致的條帶(圖5C、圖5D、圖5E、圖5F、圖5G、圖5H、圖5I)。ImageJ軟件分析表明, pET21b-His-ArsC-H5HA10(圖5H )、pET21b-SiTag3-ArsC-H5HA10(圖5I)目的蛋白的表達量均高于其他組的,約占菌體總蛋白的30%,且蛋白大部分在上清中,可溶性在90%以上,His-Tag的純化更為簡單,故選擇pET21b-His-ArsC-H5HA10做后續(xù)研究。

2.5 His-ArsC-H5HA10融合蛋白誘導表達條件的優(yōu)化

經0.2 mmol/L和0.5 mmol/L終濃度的IPTG誘導后，目的蛋白的表達量相對較高,表達量達30%,但是0.2 mmol/L IPTG誘導時蛋白可溶性為80%,0.5 mmol/L IPTG誘導時蛋白可溶性可達90%以上,終濃度0.8 mmol/L IPTG誘導時效果相對較差,目的蛋白的可溶性降低(圖6A); His-ArsC-H5HA10經18 ℃和25 ℃兩個溫度誘導后,25 ℃下的蛋白表達量較18 ℃有所提高,且可溶性表達水平也高于18 ℃下的,蛋白可溶性水平達90%以上,因此 25 ℃為最佳誘導溫度(圖6B)。

M:蛋白質相對分子質量標準; A: pET21b-His6-PAS200-H5HA10; B: pET21b- SiTag3-PAS200-H5HA10; C: pET21b-SiTag3-SUMO-H5HA10; D: pET21b-SiTag3-XTEN-H5HA10; E: pET21b-His-PEAT-H5HA10; F: pET21b-His-XTEN-H5HA10; G: pET21b-SiTag3-MBP-H5HA10; H: pET21b-His-ArsC-H5HA10; I: pET21b-SiTag3-ArsC-H5HA10 ;1:未誘導全菌;2:誘導后全菌;3:誘導后超聲破碎的上清;4:誘導后超聲破碎的沉淀。

圖5Spy-H5HA10重組蛋白的SDS-PAGE分析結果

M:蛋白質相對分子質量標準;1:未誘導的全菌;2:0.2 mmol/L IPTG誘導后的全菌;3:0.5 mmol/L IPTG誘導后的全菌;4:0.8 mmol/L IPTG誘導后的全菌;5:0.2 mmol/L IPTG誘導后的上清;6:0.5 mmol/L IPTG誘導后的上清;7:0.8 mmol/L IPTG誘導后的上清;8:0.2 mmol/L IPTG誘導后的沉淀;9:0.5 mmol/L IPTG誘導后的沉淀;10:0.8 mmol/L IPTG誘導后的沉淀;11:未誘導的全菌;12:25 ℃誘導后的全菌;13:25 ℃誘導后的上清;14:18 ℃誘導后的全菌;15:18 ℃誘導后的上清;16:25 ℃誘導后的沉淀;17:18 ℃誘導后的沉淀。

圖6His-ArsC-H5HA10融合蛋白誘導表達條件的優(yōu)化結果

2.6 Spyligase重組蛋白的可溶性分析

重組質粒pEX-His6-Cherry-TEV-Spyligase轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導表達、超聲破碎后取上清和沉淀,用SDS-PAGE凝膠電泳檢測。結果顯示在26 kDa處有與預期大小相符的目的條帶(圖7)。ImageJ軟件分析數(shù)據表明, Spyligase重組蛋白的可溶性約為95%。

M:蛋白質相對分子質量標準;1:未誘導的全菌;2:誘導后的全菌;3:誘導后的上清;4:誘導后的沉淀。

圖7Spyligase重組蛋白SDS-PAGE分析結果

2.7 Spyligase重組蛋白誘導表達條件的優(yōu)化

用終濃度分別為0.2、0.5和0.8 mmol/L的IPTG進行誘導,再經SDS-PAGE電泳, ImageJ軟件分析顯示：0.2 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG誘導時蛋白表達量均高于0.8 mmol/L IPTG誘導時的,但是0.5 mmol/L IPTG誘導時蛋白的可溶性表達水平不及0.2 mmol/L IPTG誘導時的；0.8 mmol/L IPTG的誘導效果最差(圖8A)。在18 ℃和25 ℃下分別誘導,經SDS-PAGE電泳, ImageJ軟件分析顯示,誘導溫度為25 ℃時重組蛋白的表達量和可溶性水平均高于18 ℃的,可溶性達95%(圖8B)。

2.8 重組蛋白His-ArsC-H5HA10的純化

用平衡緩沖液重懸菌體,超聲破碎后分別用含10、20、30、50、75、100、250、500 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫,SDS-PAGE電泳分析顯示目的蛋白可以通過鎳柱進行親和純化,用30 mmol/L的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白的效果最佳(圖9A)。目的蛋白與鎳柱結合后,用10、20、30、500 mmol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫,收集目的蛋白,經脫鹽處理后得到了高純度的重組蛋白(圖9B)。

M:蛋白質相對分子質量標準;1:未誘導的全菌;2:0.2 mmol/L IPTG誘導后的全菌;3:0.5 mmol/L IPTG誘導后的全菌;4:0.8 mmol/L IPTG誘導后的全菌;5:0.2 mmol/L IPTG誘導后的上清;6:0.5 mmol/L IPTG誘導后的上清;7:0.8 mmol/L IPTG誘導后的上清;8:0.2 mmol/L IPTG誘導后的沉淀;9:0.5 mmol/L IPTG誘導后的沉淀;10:0.8 mmol/L IPTG誘導后的沉淀;11:未誘導的全菌;12:25 ℃誘導后的全菌;13:25 ℃誘導后的上清;14:18 ℃誘導后的全菌;15:18 ℃誘導后的上清;16:25 ℃誘導后的沉淀;17:18 ℃誘導后的沉淀。

圖8Spyligase重組蛋白誘導表達條件的優(yōu)化結果

M:蛋白質相對分子質量標準;1:破碎后上清;2～12:分別含10、20、30、40、50、75、100、200、250、300、500 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液;13:未誘導的全菌;14:誘導后的上清;15:純化的His-ArsC-H5HA10重組蛋白。

圖9His-ArsC-H5HA10融合蛋白純化條件優(yōu)化結果

2.9 重組蛋白His-Cherry-Spyligase的純化

操作方法與2.7.1一致,圖10A結果顯示用含50 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白的效果最佳。目的蛋白與鎳柱結合后,經10、20、30、50、500 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫,收集目的蛋白,經脫鹽處理后得到了高純度的His-Cherry-Spyligase重組蛋白(圖10B)。

2.10 Spyligase和Spy-H5HA10反應的最佳比例

將已純化的重組蛋白Spyligase和His-ArsC- Spy-H5HA10按照表1分別加入到PCT緩沖溶液中,于4 ℃下反應48 h。SDS-PAGE分析顯示：在Spyligase量一定的條件下,多聚體的形成量與底物Spy-H5HA10的單體濃度呈正相關(圖11B);當Spy-H5HA10的量一定時,多聚體的形成量隨著Spyligase濃度的增高而升高,但是當Spy-H5HA10和Spyligase的比例達到1∶2時,再升高Spyligase的量對形成多聚體無明顯影響(圖11A),因此最終確定Spy-H5HA10和Spyligase反應的最佳比例為1∶2。

M:蛋白質相對分子質量標準;1:破碎后的上清;2～12:分別含10、20、30、40、50、75、100、200、250、300、500 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液;13:未誘導的全菌;14:誘導后的上清;15:純化的His-Cherry-Spyligase重組蛋白。

圖10His-Cherry-Spyligase融合蛋白純化條件優(yōu)化結果

M:蛋白質相對分子質量標準;1～20:與表1中的樣孔號對應。

M:蛋白相對分子質量標準;1: Spyligase 融合蛋白;2: Spy-H5HA10融合蛋白;3: Spyligase與Spy-H5HA10以1∶1混合;4:環(huán)化6 h;5:環(huán)化12 h;6:環(huán)化18 h;7:環(huán)化24 h;8:環(huán)化30 h;9:環(huán)化36 h;10:環(huán)化42 h;11:環(huán)化48 h;12:環(huán)化54 h;13:環(huán)化60 h;14:環(huán)化66 h。

圖12Spyligase和Spy-H5HA10反應時間優(yōu)化結果

2.11 反應時間的優(yōu)化

將Spy-H5HA10和Spyligase以1∶2混合進行反應,每6 h取樣1次,分析反應時間與環(huán)化形成量的關系。SDS-PAGE凝膠電泳分析結果(圖12)表明：在反應6 h時已發(fā)生環(huán)化,出現(xiàn)了環(huán)化單體和三聚體，且隨著反應時間的延長,環(huán)化單體和三聚體的數(shù)量逐漸增加;在18 h時,開始出現(xiàn)六聚體,隨著反應時間的延長,六聚體的數(shù)量逐漸增加;在24 h時,開始出現(xiàn)九聚體,繼續(xù)延長反應時間,環(huán)化單體及多聚體的數(shù)量都有所增加;在反應30～66 h期間，環(huán)化單體、三聚體、六聚體以及九聚體的形成量均無明顯增加。

3 討論

禽流感是由A類病毒引起的一類對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重危害的高度傳染性疾病,也是一種人獸共患傳染病[13]。目前對于禽流感的防治以滅活苗、弱毒苗或抗原蛋白亞單位疫苗為主,但是這些疫苗免疫保護性水平往往較低。有學者應用Spyligase技術在體外環(huán)化生成環(huán)化單體、多聚體，增大蛋白分子量,提高蛋白的穩(wěn)定性,獲得了較好的免疫效果[11-12〗。Spyligase技術源于SpyTag/SpyCatcher的連接反應,由SpyTag、KTag和鏈接酶Spyligase組成[11],可用于蛋白質分子的連接。KTag設計來源于SpyCatcher,在Spyligase的作用下可以與SpyTag形成共價鍵;Spyligase也來源于SpyCatcher,經人工改造后合成[11]。本實驗在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達了Spy-H5HA10和Spyligase重組蛋白,原核表達系統(tǒng)生產成本低,操作簡單易行[15]。有文獻報道在蛋白表達中可以通過促溶標簽提高蛋白的可溶性[16]。本研究應用SiTag3[17]、XTEN[18]、MBP[19]、Cherry[21]、SUMO、PAS200等10種促溶標簽與目的蛋白進行融合表達,從中篩選出了高可溶性的His6-ArsC-H5HA10重組蛋白。PAS200標簽與蛋白的串聯(lián)結構在表達后, SDS-PAGE電泳顯示其融合蛋白偏大,究其原因，可能是由于本實驗所用的PAS200標簽所含氨基酸序列具有特殊性,使結合的SDS所帶負電荷不能完全掩蓋蛋白本身所帶電荷,導致電泳時遷移變慢。在表達Spyligase蛋白時,本研究在其基因序列前插入了Cherry標簽,目的蛋白的表達可以通過觀察菌體呈現(xiàn)的顏色進行鑒別,當菌體顏色為紅色時說明目的蛋白獲得了表達,使檢測更為簡單方便。低溫誘導可以增加目的蛋白的可溶性,故我們在誘導表達中設置了25 ℃和18 ℃兩個溫度,分析發(fā)現(xiàn)25 ℃時重組蛋白的表達量更高,分析原因可能是在18 ℃低溫條件下細胞增殖緩慢。雖然18 ℃低溫可以促進蛋白正確折疊,提高可溶性,但是目的蛋白的總表達量降低了,故后續(xù)實驗選擇25 ℃進行。實驗中用的IPTG終濃度為0.5 mmol/L,考慮到IPTG可能存在的副作用,在實驗中分別設計了高劑量組0.8 mmol/L和低劑量組0.2 mmol/L,發(fā)現(xiàn)在不同濃度處理間誘導效果存在差異,高劑量的IPTG組蛋白表達量降低,0.2 mmol/L和0.5 mmol/L間差異不大,可能是由于IPTG本身具有一定毒性，不易被細菌代謝[22],而高劑量IPTG會抑制細胞增殖,使蛋白表達量降低,最終His6-ArsC-H5HA10融合蛋白采用 0.5 mmol/L IPTG進行誘導表達。His6-Cherry-Spyligase融合蛋白經0.2 mmol/L IPTG誘導表達,且目的蛋白主要在上清中,兩種蛋白均為可溶性表達。在目的蛋白序列中前引入了His6標簽[23],目的是方便利用Ni-NTA純化技術[24], 最終通過親和純化得到目的蛋白。在PCT緩沖液中, Spyligase和Spy-H5HA10充分反應,通過SDS-PAGE電泳檢測其環(huán)化形成了環(huán)化單體、三聚體、六聚體以及九聚體,形成的多聚體均為單體分子量的3倍。本研究構建的Spyligase和Spy-H5HA10原核表達載體,通過促溶標簽均提高了目的蛋白的可溶性表達水平,避免了包涵體的變性和復性處理,添加了His6標簽,便于后期重組蛋白的分離純化。本實驗進一步驗證了Spyligase環(huán)化技術在H5HA10蛋白的可用性,在體外環(huán)境下合成了H5HA10蛋白環(huán)化單體、三聚體、六聚體以及九聚體等,為后續(xù)多聚體抗原應用于禽流感基因工程疫苗的研發(fā)奠定了基礎。