天名精提取物對小鼠免疫功能的影響*

林力，王強，周玉丹，萬京樺，周國祥，徐佳琪，王子濤，肖碩，辛祖超

(1.武漢科技大學醫(yī)學院職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室、感染免疫與腫瘤微環(huán)境研究所，武漢 430065；2.枝江市人民醫(yī)院，枝江 443200)

天名精為菊科植物天名精CarpesiumabrotanoidesLinnaeus的干燥全草，在湖北廣泛分布，具有清熱化痰、解毒殺蟲、破瘀止血的功效，主要用于治療乳蛾喉痹、急慢驚風、牙痛、疔瘡腫毒、痔瘺、皮膚癢疹、毒蛇咬傷、蟲積、血瘕、吐血、血淋、創(chuàng)傷出血等癥[1]。同時，天名精也是一味很著名的民族藥，在白族、傈僳族、藏族、土家族和苗族均可藥用[2]。其主要含有倍半萜內(nèi)酯類成分，具有抗菌消炎、抗病毒、殺蟲、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[3-4]。倍半萜類化合物被報道有抗腫瘤細胞增殖和抗腫瘤血管新生的功效[4-6]。筆者通過研究天名精提取物對小鼠免疫器官、巨噬細胞吞噬功能、溶血空斑形成情況影響，從免疫學角度討論了天名精提取物對機體免疫功能影響。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級健康昆明種雄性小白鼠75只，體質(zhì)量(23±2) g，鼠齡4～5周，由武漢科技大學動物醫(yī)學中心提供，動物使用許可證號：SYXK(鄂)2012-0067，動物合格證號：42000600025754。小鼠同組同籠飼養(yǎng)，各組基礎(chǔ)日糧相同，自由進食，自然晝夜節(jié)律光照。實驗動物飼養(yǎng)室溫度(23±1) ℃，相對濕度(50±10)%，通過空調(diào)風機與外界實現(xiàn)通風換氣。

1.2藥品與試劑 天名精全草于2017年8月采集于湖北省枝江市，經(jīng)中南民族大學藥學院楊新洲教授鑒定為菊科植物天名精CarpesiumabrotanoidesLinnaeus，藥材標本(編號SC0811)存于中南民族大學藥學院標本館。天名精提取物的制備：取干燥的天名精粉末500 g，倒入5000 mL圓底燒瓶中，加入2500 mL石油醚，電熱套加熱回流提取3 h，濾過，濾渣中加入石油醚2500 mL，繼續(xù)加熱回流3 h，濾過，再重復前兩次操作，合并3次提取所得濾液，濃縮，得12.5 g石油醚部位。所剩濾渣重復石油醚部位提取操作，分別加入乙酸乙酯和甲醇，每種溶劑分別提取3次，每次3 h，合并相同的提取濾液，減壓濃縮干得到乙酸乙酯提取物26.7和43.9 g甲醇提取物。乙酸乙酯(中國醫(yī)藥集團總公司，批號：U1265400)；甲醇(中國醫(yī)藥集團總公司，批號：40030560)；石油醚(60～90 ℃，批號：816690)；亞甲基藍溶液(珠海貝索生物技術(shù)公司，批號：416082)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州微生物試劑公司，批號：YJ-135004)；可溶性淀粉(武漢洪山中南化工試劑公司，批號：2901613)；小牛血清Hanks液(武漢生物制品研究所提供，批號：KA13136)；補體(武漢生物制品研究所提供，批號：160102)；綿羊紅細胞(武漢生物制品研究所提供)；雞紅細胞混懸液的制備：于無菌操作下，取雞翅靜脈血置于三角燒瓶中，加入相當血液量5倍的Alserver's液，混合均勻后，4 ℃貯存[7]。臨時用時吸取紅細胞用0.9%氯化鈉溶液洗3次，離心速度為3000 r·min-1，離心半徑為45 cm，離心時間為10 min，直至紅細胞壓積穩(wěn)定，然后用0.9%氯化鈉溶液配置成1%雞紅細胞(red blood cell，RBC)溶液。

1.3主要儀器 平行蒸發(fā)儀(EZ-2 型，GeneVac公司)；低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；電子天平(上海天平儀器廠，感量：0.01 mg)；Nikon光學顯微鏡；電熱套(上海坤盟儀器設(shè)備廠)。

1.4動物分組及給藥方法 按隨機數(shù)字表法將75只小鼠隨機分為5組，每組15只，根據(jù)前期預實驗結(jié)果進行了劑量確定，設(shè)立天名精乙酸乙酯提取物小劑量組、甲醇提取物小劑量組、天名精乙酸乙酯提取物大劑量組、甲醇提取物大劑量組和空白對照組。采用灌胃方式給藥，藥物現(xiàn)配現(xiàn)用?？瞻讓φ战M每天給予0.9%氯化鈉溶液，天名精小、大劑量組按50，100 mg·kg-1給藥，每天給藥1次，連續(xù)10 d，每次1 mL。

1.5脾臟質(zhì)量和臟器指數(shù)的測定 第10天對小鼠進行稱質(zhì)量后，立刻處死小鼠，然后取脾臟于電子天平稱質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)后，計算脾臟臟器指數(shù)：脾臟臟器指數(shù)=免疫器官質(zhì)量/體質(zhì)量[8]。

1.6吞噬細胞功能檢測 第7天將小鼠腹腔注射6%營養(yǎng)淀粉肉湯1 mL，刺激小白鼠腹腔產(chǎn)生無菌性炎癥，誘導巨噬細胞的活化、聚集。第10天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液配制的1%雞血細胞1 mL，30 min后注射2 mL小牛血清Hanks液稀釋腹腔液，處死小鼠，立即剖腹，用尖頭吸管沖洗小鼠腹腔液以收集盡可能多的巨噬細胞[9]。將腹腔液于潔凈試管與1或2滴1%亞甲基藍溶液混合，均勻涂抹于載玻片上，37 ℃溫箱干燥，生物學顯微鏡油鏡檢測，計算吞噬指數(shù)和吞噬百分比：吞噬率(%)=(吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/200個巨噬細胞)×100%；吞噬指數(shù)=200個巨噬細胞吞噬的雞紅細胞總數(shù)/200個巨噬細胞。

1.7溶血空斑檢測 第6天，將5%綿羊紅細胞0.4 mL(約4×106個)腹腔注射到小鼠體內(nèi)，第10天處死小鼠，剖腹分離脾臟，按文獻[10]法測定小鼠溶血空斑形成情況。借助放大鏡，進行空斑計數(shù)，計算1×106個脾細胞所含溶血空斑數(shù)。

2 結(jié)果

2.1天名精提取物對小鼠免疫器官的影響 與空白對照組比較，天名精乙酸乙酯提取物小、大劑量組與甲醇提取物小、大劑量組小鼠外周免疫器官脾臟質(zhì)量與臟器指數(shù)均明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，天名精乙酸乙酯提取物和甲醇提取物小劑量組效果更佳。見表1。

2.2天名精提取物對小鼠腹腔巨噬細胞功能影響 與空白對照組比較，天名精乙酸乙酯提取物小、大劑量組與甲醇提取物小、大劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2，圖1。

表15組小鼠脾臟質(zhì)量和臟器指數(shù)比較

組別劑量/(mg·kg-1·d-1)脾臟質(zhì)量/mg臟器指數(shù)空白對照組117.6±10.893.89±0.13乙酸乙酯 小劑量組50198.6±20.11?15.94±0.62?1 大劑量組100174.8±16.77?15.39±0.47?1甲醇 小劑量組50170.6±10.09?15.30±0.30?1 大劑量組100148.6±12.09?14.46±0.29?1

與空白對照組比較，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

2.3天名精提取物對小鼠溶血空斑形成影響 與空白對照組比較，天名精乙酸乙酯提取物小、大劑量組與甲醇提取物小、大劑量組溶血空斑形成數(shù)均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明天名精乙酸乙酯、甲醇提取物小、大劑量組均可顯著促進小鼠溶血空斑的形成，天名精乙酸乙酯提取物和甲醇提取物小劑量組效果更好。見圖2，表3。

表25組小鼠巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)比較

組別劑量/(mg·kg-1·d-1)吞噬率/%吞噬指數(shù)空白對照組35.49±1.640.37±0.06乙酸乙酯 小劑量組5056.60±3.97?11.09±0.07?1 大劑量組10050.80±3.96?11.01±0.05?1甲醇 小劑量組5053.40±3.20?10.68±0.03?1 大劑量組10057.40±1.34?11.01±0.06?1

與空白對照組比較，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

3 討論

天名精全草四季可采摘，廣泛分布于湖北地區(qū)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中天名精被列為上品，入脾、胃、肝三經(jīng)。本課題組制備了天名精的環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲醇3種溶劑提取物。前期，運用甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)測試各種提取物對肺癌、胃癌、宮頸癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌細胞株的體外抗腫瘤活性，結(jié)果顯示天名精的乙酸乙酯、甲醇提取物對各種腫瘤細胞株具有廣譜的抗癌效果(在濃度為20 μg·mL-1時，抑制率>50%)，其中對肝癌細胞株HepG2和Huh7的活性最強(5 μg·mL-1時，抑制率>95%)，且顯示出良好的濃度-效應(yīng)曲線關(guān)系。天名精提取物和所含的化學成分已顯示抗菌、殺蟲、抗炎、抗腫瘤等活性，但它對機體免疫功能的影響研究鮮見報道。基于此，課題組通過研究天名精乙酸乙酯、甲醇提取物對小鼠脾臟質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、腹腔巨噬細胞功能及溶血空斑形成情況的影響，探討天名精提取物對小鼠特異性和非特異性免疫功能的作用。

A.空白對照組；B.乙酸乙酯小劑量組；C乙酸乙酯大劑量組；D.甲醇小劑量組；E.甲醇大劑量組

A.blank control group；B.low-dose ethyl acetate group；C.high-dose ethyl acetate group；D.low-dose methanol group；E.high-dose methanol group

Fig.1Detectiononthefunctionofperitonealmacrophagesinfivegroupsofmice(×1000)

A.空白對照組；B.乙酸乙酯小劑量組；C乙酸乙酯大劑量組；D.甲醇小劑量組；E.甲醇大劑量組

A.blank control group；B.low-dose ethyl acetate group；C.high-dose ethyl acetate group；D.low-dose methanol group；E.high-dose methanol group

Fig.2Detectionresultsofantibody-formingcellsinvitroinfivegroupsofmousespleens(×100)

表35組小鼠溶血空斑形成情況比較

組別劑量/(mg·kg-1·d-1)溶血空斑形成數(shù)空白對照組361±11.70乙酸乙酯 小劑量組501368±47.56?1 大劑量組1001280±125.98?1甲醇 小劑量組50498±42.10?1 大劑量組100472±20.40?1

與空白對照組比較，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

脾臟在出生后由造血器官演變?yōu)樽畲蟮耐庵苊庖咂鞴佟Ｆ⑴K是淋巴細胞定居的重要場所，其中B細胞占60%，T細胞占40%，脾臟還負責對血源性抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答[11]。實驗結(jié)果表明，天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物可促進小鼠脾臟生長、提高脾臟臟器指數(shù)，尤其是小劑量乙酸乙酯提取物、甲醇提取物效果更顯著。巨噬細胞具有強大的吞噬能力和消化能力，是參與和促進炎癥的重要細胞，是體內(nèi)重要的抗原提呈細胞，巨噬細胞吞噬功能對非特異性免疫起著不可或缺的影響，其檢測結(jié)果反映非特異性免疫功能強弱；溶血空斑的本質(zhì)是介導體液免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞，其檢測結(jié)果能反映特異性體液免疫功能強弱[12]。實驗結(jié)果顯示，天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬指數(shù)、吞噬百分率，增強了機體的非特異性免疫功能，乙酸乙酯提取物以小劑量組效果更優(yōu)，而甲醇提取物以大劑量效果更為顯著。天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物促進了溶血空斑的形成，提高B細胞產(chǎn)生抗體的能力，增強機體的特異性體液免疫功能。天名精對機體免疫功能的促進作用，小劑量組效果更佳，這主要與中藥的雙向調(diào)節(jié)有關(guān)：在一定濃度內(nèi)中藥天名精可以增強機體免疫，當天名精劑量過高時，其增強機體免疫的作用就不如小劑量組。結(jié)果提示中藥天名精既可以增強正常的免疫功能，又可以使免疫增強處于一定范圍內(nèi)，防止免疫功能過于亢進[13-14]。

天名精主要化學成分為萜類和黃酮類成分，萜類成分以單萜和倍半萜骨架為主，主要含有桉葉烷型倍半萜、吉瑪烷型倍半萜、愈創(chuàng)木烷型倍半萜，另含有貝殼杉皖型二萜等結(jié)構(gòu)類型；黃酮類以黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等骨架為主。倍半萜類化合物被報道過有抗腫瘤細胞增殖和抗腫瘤血管新生的功效。目前國內(nèi)在天名精的開放應(yīng)用研究還只是處于起步階段，天名精主要化學成分開發(fā)前景仍在研究階段，是否能成為人體抗腫瘤的化學新物質(zhì)，亟待進一步開展研究。