采后苯并噻重氮處理對(duì)‘玉金香’甜瓜單萜類香氣及其代謝關(guān)鍵酶的影響分析

王 雨，李霽昕，李經(jīng)緯，郝蘭蘭，胡妍蕓，王 博，蔣玉梅,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730070）

‘玉金香’甜瓜是我國(guó)西北地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，屬于呼吸躍變型果實(shí)，采后極易被病原菌侵染而發(fā)生腐爛[1-2]。苯并噻重氮（benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester，BTH）是目前常用的一種典型的植物抗病誘導(dǎo)劑[3]，能夠誘導(dǎo)甜瓜果實(shí)產(chǎn)生抗病性，有效降低甜瓜果實(shí)的采后腐爛率[4-5]。香氣物質(zhì)的組成和含量是衡量甜瓜品質(zhì)的重要指標(biāo)[6]，已有240多種香氣物質(zhì)被分離檢測(cè)[7]，根據(jù)合成前體，其代謝途徑可分為脂肪酸途徑、氨基酸途徑和碳水化合物途徑[8]。目前研究顯示采后BTH誘抗處理可提高甜瓜果肉和果皮組織的脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性，進(jìn)而影響脂肪酸途徑香氣組分代謝[9]。同時(shí)，采后BTH處理會(huì)降低‘玉金香’果實(shí)氨基酸含量，抑制相關(guān)代謝酶活性，進(jìn)而改變酯類香氣組分的釋放[10]。關(guān)于采后BTH處理對(duì)萜烯類香氣代謝的影響分析及研究目前鮮見報(bào)道。

以碳水化合物為前體的萜烯類合成途徑包括甲基磷酸赤蘚糖途徑（methyl-erythritol-4-phosphate pathway，MEP）和甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA）[11]。單萜類香氣物質(zhì)以糖的中間代謝產(chǎn)物3-磷酸甘油醛、丙酮酸為前體，經(jīng)MEP途徑生成香葉基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP），再由單萜合成酶催化生成[12-13]，其中l(wèi)-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）是MEP代謝途徑中的限速酶[14]。

本研究以厚皮甜瓜‘玉金香’為實(shí)驗(yàn)材料，監(jiān)測(cè)采后常溫貯藏期間單萜類香氣組分及其代謝酶DXR活力的變化，分析其相關(guān)性，探討采后BTH誘抗處理對(duì)DXR活力和單萜類香氣形成的影響，以期為甜瓜果實(shí)香氣代謝機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘玉金香’厚皮甜瓜，2017年6月（花后45 d）采自甘肅省皋蘭縣什川鎮(zhèn)，果發(fā)泡網(wǎng)袋包裝，36 個(gè)/箱，當(dāng)天運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，室溫（（22±2）℃、相對(duì)濕度55%～65%）貯藏。

BTH（純度98%）、2-辛醇（色譜純） 美國(guó)Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE1300GC-ISQ300氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TG-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）、Genesis 10S型紫外-可見分光光度儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅（divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-siloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國(guó)Surpelco公司；CP 214型電子分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 BTH誘抗處理

參照Vieira dos Santos等[15]的方法并略作修改。于采收當(dāng)日，選擇成熟度、大小相近、無損傷和蟲咬的果實(shí)，分別采用100 mg/L BTH溶液（蒸餾水配制，BTH處理組）、蒸餾水（CC組）浸泡10 min，以未處理果實(shí)為對(duì)照（CK組）。室溫條件（（22±2）℃、相對(duì)濕度55%～65%）貯藏。

1.3.1.2 取樣

參照Bi Yang等[16]的方法并略作修改。貯藏第0、2、4、6、8、l0、12、14天隨機(jī)抽取外觀相近、無損傷的‘玉金香’果實(shí)樣品，每組10 個(gè)，分別取果實(shí)“赤道”附近的果皮組織（皮下2～5 mm）、果肉組織（皮下5～8 mm），切小塊混勻，每3.0 g錫箔紙包裹液氮冷凍，-80 ℃保存用于測(cè)定酶活力；香氣檢測(cè)樣品每5.0 g混勻的小塊置于20 mL頂空瓶中，加入1.0 g NaCl、內(nèi)標(biāo)2-辛醇（8.82 mg/L）20 μL，密封混勻，-20 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 香氣含量的測(cè)定

參照Zhang Bo等[17]的方法并修改。樣品常溫解凍，40 ℃下平衡30 min。插入活化的SPME裝置，40 ℃頂空吸附30 min。GC進(jìn)樣口熱解析10 min。

GC條件：進(jìn)樣口溫度240 ℃，不分流進(jìn)樣，20 min后打開分流閥，分流比30∶1；升溫程序：初溫50 ℃，以3 ℃/min升至170 ℃，保持10 min；載氣（He）流速1.0 mL/min。

MS條件：電子轟擊離子源（electron impact ionization，EI）；電子能量70 eV；傳輸線溫度180 ℃；離子源溫度240 ℃；質(zhì)譜掃描范圍m/z 40～350。

1.3.2.2 酶活力的測(cè)定

DXR活力的測(cè)定參照Hasunuma等[18]的方法并略作修改。取低溫保存樣品3.0 g（冷凍狀態(tài)）于-20 ℃預(yù)冷研缽，加6.0 mL提取液（含150 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L β-巰基乙醇、1 mmol/L二磷酸硫胺），冰浴條件下研磨勻漿，15 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液，為粗酶液。反應(yīng)混合液（含100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、1 mmol/L MnCl2、0.12 mmol/L NADPH、0.25 mmol/L DXP）3.0 mL，加入1 mL粗酶液，利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定340 nm波長(zhǎng)處的吸光度，每隔20 s讀數(shù)，連續(xù)測(cè)定3 min。以不含粗酶液的反應(yīng)混合液為對(duì)照。酶活力單位為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。每個(gè)樣品檢測(cè)做3 次獨(dú)立重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

香氣物質(zhì)經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索NIST Library（11）、Wiley Library，結(jié)合文獻(xiàn)人工圖譜解析定性，內(nèi)標(biāo)法半定量。采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析（相關(guān)系數(shù)法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)甜瓜果實(shí)貯藏過程中DXR活力的影響

圖 1 BTH處理對(duì)貯藏過程中甜瓜DXR活力的影響Fig. 1 Effect of BTH treatment on DXR activity in muskmelon during storage

由圖1A、B可知，采后貯藏期間果皮和果肉試樣中DXR活力均呈單峰型變化，CK和CC組果皮和果肉試樣活力峰值均在第6天出現(xiàn)，BTH處理可抑制DXR活力，并使高峰延遲2 d出現(xiàn)，條件因子水使DXR活力高峰值增加，貯藏第0～2天，CC組果皮和果肉試樣DXR活力低于CK組，高于BTH處理組；第2～6天，CC組DXR活力急劇上升；貯藏的第10天，CC組的DXR活力比CK組低，CC組果皮和果肉試樣DXR活力分別較CK組低3.41%和4.35%。貯藏期間CC組DXR果皮和果肉試樣活力峰值分別為（4.11±0.14）、（1.81±0.05）U/g，BTH處理組果皮和果肉中DXR活力比CC組分別降低了19.48%和25.49%。果皮試樣DXR活力整體高于果肉試樣，CK、CC組和BTH處理組果皮試樣DXR活力峰值較果肉試樣分別高1.2、1.3、1.4 倍。由圖1A可知，對(duì)于果皮，BTH處理組峰值為（3.48±0.11）U/g，分別比CK和CC組峰值低4.85%和15.15%。由圖1B可知，對(duì)于果肉，BTH處理組峰值為（1.48±0.11）U/g，比CK和CC組低9.78%和18.23%。

前人報(bào)道‘玉金香’厚皮甜瓜貯藏期間乙烯釋放規(guī)律為：常溫貯藏期間CC組果實(shí)乙烯于第6天出現(xiàn)釋放高峰，BTH處理后，乙烯釋放高峰提前，釋放量受到顯著抑制[19]。結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)CK和CC組果皮和果肉試樣DXR活力達(dá)到峰值的時(shí)間與乙烯躍變的時(shí)間相一致，均出現(xiàn)在第6天，BTH處理后DXR活力也被抑制。由此推斷，厚皮甜瓜‘玉金香’DXR活力與乙烯的釋放存在一定的相關(guān)性，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

2.2 不同處理對(duì)甜瓜果實(shí)貯藏過程中單萜類香氣釋放量的影響

實(shí)驗(yàn)甜瓜果實(shí)共檢出代謝自MEP途徑的單萜類香氣組分9 種。包括1 種無環(huán)單萜（香葉醇）、7 種單環(huán)單萜（α-萜品醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、L-香芹醇、對(duì)-薄荷-(7),8(10)-二烯-9-醇、反式-(+)-異檸檬烯、L-薄荷醇、水茴香醛）、1 種三環(huán)單萜（桉葉油醇）。

2.2.1 不同處理對(duì)甜瓜果實(shí)貯藏過程中無環(huán)單萜類香氣物質(zhì)釋放量的影響

香葉醇在果皮和果肉樣品中均呈雙峰型變化，各樣品峰值出現(xiàn)時(shí)間一致。BTH處理組香葉醇含量始終低于CK和CC組。由圖2A可知，對(duì)于果皮，貯藏前期各處理組香葉醇的釋放量均呈上升趨勢(shì)，分別于第4天和第8天出現(xiàn)釋放高峰。第8天CC組釋放峰值為（0.432±0.037）ng/g，分別是CK組和BTH處理組的1.27 倍和1.59 倍。由圖2B可知，對(duì)于果肉，香葉醇的釋放量分別在第2天和第8天達(dá)到釋放高峰。CK、CC組和BTH處理組第二次釋放高峰值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于第一次釋放高峰值，分別是第一次釋放高峰值的4.00、3.58、6.03 倍。CK組和BTH處理組第8天釋放峰值分別為（1.872±0.167）ng/g和（1.438±0.216）ng/g，分別是CC組的87.98%和67.57%。

圖 2 BTH處理對(duì)貯藏過程中甜瓜MEP途徑代謝無環(huán)單萜類香氣物質(zhì)釋放量的影響Fig. 2 Effect of BTH treatment on release of aroma-active acyclic monoterpene compounds through methyl-erythritol-4-phosphate pathway from muskmelon during storage

2.2.2 不同處理對(duì)甜瓜果實(shí)貯藏過程中單環(huán)單萜類香氣物質(zhì)釋放量的影響

實(shí)驗(yàn)甜瓜果實(shí)檢測(cè)出單環(huán)單萜類香氣α-萜品醇、L-香芹醇、對(duì)-薄荷-(7),8(10)-二烯-9-醇、L-薄荷醇和反式-(+)-異檸檬烯在樣品貯藏期間呈雙峰型變化，順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇CK組呈單峰型變化，CC組和BTH處理組呈雙峰型變化，水茴香醛呈單峰型變化。

α-萜品醇在果肉樣中的釋放量是單萜類香氣物質(zhì)中最高的。由圖3A1可知，對(duì)于果皮，CC組在第2天和第6天達(dá)到釋放高峰，CK組和BTH處理組第0～2天急速下降，第4天和第10天達(dá)到峰值，兩者變化趨勢(shì)一致；CC組第6天釋放峰值為（0.623±0.071）ng/g，分別是CK組和BTH處理組第二次（10 d）峰值的1.26 倍和1.70 倍。由圖3A2可知，對(duì)于果肉，各處理組α-萜品醇的釋放量均分別在第2天和第8天達(dá)到高峰，CK、CC組和BTH組第二次釋放峰值分別是第一次釋放峰值的5.61、4.21 倍和5.90 倍；BTH處理組釋放量始終低于CC組，BTH處理組第8天釋放峰值為（2.320±0.211）ng/g，分別是CK和CC組釋放峰值的78.31%和70.55%。

順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇在果皮和果肉中釋放規(guī)律不同。CC組和BTH處理組釋放高峰出現(xiàn)在第2天和第6天，CK組第4天達(dá)到釋放高峰。由圖3B1可知，對(duì)于果皮，貯藏第6天CC組釋放峰值為（0.347±0.043）ng/g，分別是CK組和BTH處理組第二次釋放峰值的1.22 倍和1.43 倍。由圖3B2可知，對(duì)于果肉，BTH處理組第二次釋放峰值是第一次釋放峰值的5.14 倍，BTH處理組第6天釋放峰值為（0.890±0.143）ng/g，分別是CK組和CC組第二次釋放峰值的81.52%和63.97%。

由圖3C1可知，對(duì)于果皮，CC組L-香芹醇在第2天和第6天達(dá)到釋放高峰，釋放量明顯高于CK組和BTH處理組，10 d后含量低于CK組，高于BTH處理組；CK組和BTH處理組第二次釋放高峰較CC組推遲2 d出現(xiàn)；第6天CC組釋放峰值為（0.580±0.056）ng/g，分別是CK組和BTH處理組第二次峰值的1.23、1.44 倍。由圖3C2可知，對(duì)于果肉，CK組和BTH處理組變化趨勢(shì)相一致，CC組8 d后含量低于CK組和BTH處理組，BTH處理組第8天釋放峰值為（0.430±0.057）ng/g，分別是CK組和CC組第二次峰值的80.52%和62.41%。

對(duì)于果皮和果肉，CC組對(duì)-薄荷-(7),8(10)-二烯-9-醇第一次釋放高峰均出現(xiàn)在第2天，含量低于CK組，高于BTH處理組，第二次釋放高峰均出現(xiàn)在第6天。由圖3D1可知，對(duì)于果皮，CK組和BTH處理組第二次釋放峰值較CC組推遲2 d出現(xiàn)。第6天CC組釋放峰值為（0.524±0.054）ng/g，分別是CK組和BTH處理組第二次釋放峰值的1.19、1.50 倍；由圖3D2可知，對(duì)于果肉，CC組和BTH處理組變化趨勢(shì)相一致，BTH處理組第6天釋放峰值為（1.280±0.172）ng/g，分別是CK組和CC組第二次釋放峰值的90.67%和59.20%。

由圖3E1可知，對(duì)于果皮，CC組L-薄荷醇在第2天和第6天達(dá)到釋放高峰，CK組和BTH處理組在貯藏前2 d釋放量呈下降趨勢(shì)，第4天和第8天達(dá)到峰值，貯藏第10～14天，L-薄荷醇釋放量再次升高；第6天CC組釋放峰值為（1.214±0.173）ng/g，分別是CK組和BTH處理組第二次釋放峰值的1.22、1.62 倍。由圖3E2可知，對(duì)于果肉，BTH處理組第二次釋放高峰較CK和CC組推遲2 d出現(xiàn)，BTH處理組第8天釋放峰值為（0.787±0.145）ng/g，分別是CK和CC組第二次釋放峰值的79.82%和55.19%（第6天）。

由圖3F1可知，對(duì)于果皮，CK和CC組反式-(+)-異檸檬烯釋放高峰均出現(xiàn)在第2天和第6天，BTH處理組第二次釋放高峰較CC和CK組推遲2 d，貯藏第10～14天，反式-(+)-異檸檬烯釋放量略有上升，第6天CC組釋放峰值為（1.991±0.158）ng/g，分別是CK組和BTH處理組第二次峰值的1.15、1.59 倍。由圖3F2可知，對(duì)于果肉，各處理組差異較大，BTH處理組第二次釋放高峰較CC組推遲4 d出現(xiàn)，BTH處理組第10天釋放峰值為（2.067±0.280）ng/g，分別是CK和CC組第二次釋放峰值的82.31%和71.99%。

水茴香醛在果肉試樣中未檢出。由圖3G1可知，對(duì)于果皮，CK組水茴香醛在第4天達(dá)到釋放高峰，CC組和BTH處理組的釋放高峰則出現(xiàn)在貯藏第6天，釋放高峰后，樣品釋放量急劇下降，CC組釋放峰值為（0.527±0.042）ng/g，分別是CK組和BTH處理組的1.14 倍和1.43 倍。

圖 3 BTH處理對(duì)貯藏過程中甜瓜MEP途徑代謝單環(huán)單萜類香氣物質(zhì)釋放量的影響Fig. 3 Effect of BTH treatment on release of aroma-active monocyclic monoterpene compounds through the methyl-erythritol-4-phosphate pathway from muskmelon during storage

2.2.3 不同處理對(duì)甜瓜果實(shí)貯藏過程中三環(huán)單萜類香氣物質(zhì)釋放量的影響

桉葉油醇在果皮樣中未檢測(cè)出，果肉樣中呈單峰型變化。由圖4可知，對(duì)于果肉，CC組貯藏第0天未檢測(cè)出，之后急劇增加，第6天達(dá)到釋放高峰，CK組和BTH處理組貯藏前2 d未檢測(cè)出，之后緩慢上升，分別在第8天和第10天達(dá)到釋放高峰。BTH處理組釋放峰值為（1.069±0.198）ng/g，分別是CK組和CC組的69.40%和50.72%。

圖 4 BTH處理對(duì)貯藏過程中甜瓜MEP途徑代謝三環(huán)單萜類香氣物質(zhì)釋放量的影響Fig. 4 Effect of BTH treatment on release of aroma-active tricyclic monoterpene compounds through the methyl-erythritol-4-phosphate pathway from muskmelon during storage

由此可見，BTH處理可抑制單萜類香氣物質(zhì)的釋放，改變其釋放峰值出現(xiàn)時(shí)間。條件因子水會(huì)促進(jìn)釋放高峰前單萜類香氣物質(zhì)的釋放，8 d后則在一定程度上減少了單萜類香氣物質(zhì)的釋放，但無明顯作用規(guī)律。

2.3 甜瓜貯藏過程中DXR活力與單萜香氣物質(zhì)釋放量相關(guān)性分析

由表1可知，CK組α-萜品醇含量與DXR活力呈負(fù)相關(guān)，其他8 種單萜類香氣物質(zhì)含量都與DXR活力呈正相關(guān)，香葉醇、反式-(+)-異檸檬烯、水茴香醛含量與DXR活力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。由表2可知，采后BTH處理，對(duì)L-薄荷醇、桉葉油醇含量與DXR活力相關(guān)性無影響；但會(huì)提高順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、L-香芹醇、對(duì)-薄荷-(7),8(10)-二烯-9-醇、水茴香醛含量與DXR活力的相關(guān)性；BTH處理組的α-萜品醇含量與DXR活力相關(guān)性由CK組的負(fù)相關(guān)變?yōu)檎嚓P(guān)。反式-(+)-異檸檬烯含量與DXR活力的相關(guān)性則會(huì)被BTH處理減弱。

表 1 CK組DXR活力與單萜類香氣物質(zhì)釋放量相關(guān)性Table 1 Correlation analysis of DXR activity with release of aroma-active monoterpenes from control samples

表 2 BTH處理組DXR活力與單萜類香氣物質(zhì)釋放量相關(guān)性Table 2 Correlation analysis of DXR activity with release of aroma-active monoterpenes from BTH-treated samples

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究表明采后BTH處理可抑制‘玉金香’甜瓜DXR活力，延遲其活力峰值的出現(xiàn)，改變單萜類香氣物質(zhì)含量與DXR活力的相關(guān)性，進(jìn)而影響單萜類香氣的釋放。已報(bào)道的研究顯示糖代謝中的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生的產(chǎn)物3-磷酸甘油醛、丙酮酸及乙酰CoA是萜類物質(zhì)合成的前體[20]。以3-磷酸甘油醛和丙酮酸為原料經(jīng)MEP途徑是單萜合成的最主要途徑[21]。DXR是MEP途徑中的關(guān)鍵限速催化酶[22]。DXR催化的反應(yīng)是MEP途徑中“碳流”的分支點(diǎn)，也是調(diào)控萜類化合物合成的有效靶點(diǎn)[23]。研究人員從薄荷中分離得到DXR基因，并將DXR基因連接CaMV 35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移到薄荷中，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株的薄荷精油（多為單萜化合物）含量與對(duì)照相比增高，最高增幅可達(dá)50%[24]。姜花萜類代謝途徑以MEP途徑為主，經(jīng)磷甘霉素（可抑制MEP途徑中DXR活力）處理后，姜花萜類揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量與對(duì)照相比降低了90%以上[25]。這些報(bào)道佐證了本實(shí)驗(yàn)的推斷，采后BTH處理可通過抑制MEP途徑DXR活力，進(jìn)而影響厚皮甜瓜‘玉金香’的單萜類香氣的生成和釋放。

從感官品質(zhì)的角度分析，單萜類香氣大都帶有濃郁的果香、花香和木香[26-27]，如香葉醇具有橙子花香味[28]；α-萜品醇具有帶甜的濃青香和木青香[29]；反式-(+)-異檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣[30]，采后BTH處理減少了該類物質(zhì)的釋放，進(jìn)而會(huì)減弱樣品甜瓜甜香和花香感，影響其香氣品質(zhì)，這與消費(fèi)者對(duì)BTH處理甜瓜樣品的感官認(rèn)知基本一致。

4 結(jié) 論

‘玉金香’甜瓜果皮和果肉中共檢出9 種單萜類香氣組分，其中8 種單萜類香氣物質(zhì)含量與DXR活力呈正相關(guān)；采后BTH處理在一定程度上抑制了甜瓜DXR活力和單萜類香氣物質(zhì)的釋放，延遲了DXR活力峰值出現(xiàn)，改變了單萜類香氣釋放規(guī)律及其與DXR活力的相關(guān)性。由此可見，采后BTH處理可通過抑制‘玉金香’甜瓜DXR活力，延遲活力峰值的出現(xiàn)，改變單萜類香氣與DXR活力的相關(guān)性，進(jìn)而影響單萜類香氣的釋放。條件因子水對(duì)DXR活力及其產(chǎn)物單萜類香氣物質(zhì)釋放均有影響，但其作用規(guī)律和機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。