大蒜精油對(duì)熏馬腸中德氏乳桿菌產(chǎn)腐胺的影響機(jī)制

黃笠原，毛 順，李蕊婷，王勇勤，于紅紅，盧士玲*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

腐胺是一種生物胺，經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵肉制品中。它能夠與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺[1]，過量攝入對(duì)人體有害，Gardini等的研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)展相關(guān)[2]。多種微生物都能通過一系列途徑形成腐胺。大量研究證實(shí)微生物主要通過胍基丁胺脫亞胺酶（agmatine deiminase，AGDI）途徑合成腐胺：首先精氨酸脫羧基形成胍基丁胺，然后胍基丁胺去亞氨基化生成腐胺[3]。這個(gè)途徑中的基因簇有調(diào)節(jié)基因aguR以及分解代謝基因aguB、aguD、aguA和aguC[4-5]共轉(zhuǎn)錄成的多基因mRNA（操縱子aguBDAC）[6]。

由AGDI基因簇第1個(gè)基因編碼的AguR是一種跨膜蛋白，它作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的一部分可以感受到細(xì)胞外的胍基丁胺濃度，從而調(diào)節(jié)操縱子aguBDAC的轉(zhuǎn)錄[7]，aguBDAC的轉(zhuǎn)錄水平與腐胺的生成息息相關(guān)。aguR的表達(dá)量通常很低，但可以確保細(xì)胞表面的AguR充當(dāng)胍基丁胺感應(yīng)器。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)aguR的表達(dá)不受葡萄糖濃度[8]、胍基丁胺濃度[6]以及培養(yǎng)基pH值[9]的影響。胍基丁胺可以使AguR二聚化，結(jié)合羧基上的碳使分解代謝基因aguBDAC開始轉(zhuǎn)錄，腐胺由此產(chǎn)生[6]。

目前有研究表明，洋蔥、大蒜、肉桂等一些植物精油對(duì)大多數(shù)細(xì)菌有抑制作用[10]，也有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素和水溶性大蒜粉等大蒜產(chǎn)品會(huì)抑制金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、大腸桿菌等病原菌的生長(zhǎng)[11]。但對(duì)于大蒜精油是否對(duì)微生物產(chǎn)腐胺有抑制作用，以及是否影響產(chǎn)腐胺途徑中相關(guān)的基因表達(dá)的研究罕見報(bào)道。本研究所采用的大蒜精油由超臨界CO2法從大蒜中萃取，是一種天然無公害的添加劑；實(shí)驗(yàn)中使用的德氏乳桿菌是從熏馬腸中分離出的雜菌，具有較強(qiáng)的產(chǎn)腐胺能力。因此，本研究在德氏乳桿菌純菌體系與熏馬腸體系中探究大蒜精油對(duì)其的作用效果，并從分子生物學(xué)角度研究不同濃度大蒜精油對(duì)供試菌參與AGDI途徑產(chǎn)腐胺基因簇的影響，明確大蒜精油影響熏馬腸中德氏乳桿菌產(chǎn)腐胺的機(jī)制，以期為大蒜精油應(yīng)用于發(fā)酵食品中以提高其安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii），GenBank登錄號(hào)為MF661779，由石河子大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室從熏馬腸中分離保存，并送華大基因公司測(cè)序。

大蒜精油 仲景大廚房股份有限公司；吐溫20（化學(xué)純）、甲醇、乙腈（色譜純） 天津福晨化學(xué)試劑廠；改良MRS培養(yǎng)基（半乳糖代替葡萄糖作為碳源）北京奧博星生物試劑公司；胍基丁胺（體積分?jǐn)?shù)97%）、腐胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%） 美國Sigma公司；Trizol試劑 美國Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒北京全式金生物技術(shù)有限公司；Bestar?SybrGreen qPCR mastermix、ROX Reference Dye 德國DBI公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；ND2000C型微量核酸測(cè)定儀 香港基因有限公司；高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；M×3000P型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國安捷倫科技公司；超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）儀 美國沃特世公司；T25 DS 25型勻漿機(jī)德國IKA公司；9020-0094 KBF 240型恒溫恒濕培養(yǎng)箱德國Binder公司。

1.3 方法

1.3.1 供試菌菌懸液的制備

將在-18 ℃斜面保藏的從熏馬腸中分離的德氏乳桿菌活化，用MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)活化成功的菌株，并稀釋菌懸液至104～105CFU/mL備用。

1.3.2 純菌體系中大蒜精油對(duì)供試菌生長(zhǎng)作用的測(cè)定

準(zhǔn)備一批5.0 mL含體積分?jǐn)?shù)0.4%胍基丁胺溶液與體積分?jǐn)?shù)0.005%磷酸吡哆醛溶液的MRS液體培養(yǎng)基，分別加入由吐溫20溶解的大蒜精油，使其終質(zhì)量濃度分別為0 mg/mL（不添加大蒜精油）、1/2最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）、MIC[12]，混勻后接入供試菌液。37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，每隔4 h取樣，以含相應(yīng)質(zhì)量濃度大蒜精油的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)OD600nm，并用pH計(jì)測(cè)pH值，每組樣品各做3 個(gè)平行。

1.3.3 AGDI相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

1.3.3.1 RNA的提取

取1.3.2節(jié)中生長(zhǎng)至穩(wěn)定期的各組菌液2.0 mL，離心得菌體后采用Trizol法提取細(xì)菌總RNA。提取完成后用微量核酸測(cè)定儀測(cè)RNA濃度及其OD260nm、OD280nm，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.3.3.2 cDNA的合成

將1.3.3.1節(jié)中提取所得的各組RNA用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，20 μL體系中加入500 ng總RNA，按試劑盒說明書操作。

1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄qPCR法測(cè)定基因相對(duì)表達(dá)量

向無酶的八連管中加入12.5 μL Bestar?SybrGreen qPCR mastermix、1 μL cDNA模板和上、下游引物（表1）各0.5 μL，加入ddH2O至25 μL，最后添加0.1×ROX Reference Dye，輕微離心混勻反應(yīng)液，作為反轉(zhuǎn)錄qPCR（reverse transcription qPCR，RT-qPCR）反應(yīng)體系用于上機(jī)檢測(cè)。每組基因做3 組平行，所采用的擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、55 ℃34 s、72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。以MIC大蒜精油組為對(duì)照，采用2-ΔΔCt法[14]計(jì)算另外兩組的aguR和aguB相對(duì)表達(dá)量。

表 1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers used for RT-qPCR

1.3.4 UPLC對(duì)培養(yǎng)液腐胺積累量的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用0.4 mol/L高氯酸溶解10 mg腐胺標(biāo)準(zhǔn)品，定容至10 mL，分別稀釋成終質(zhì)量濃度為5、10、20、25、50、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4.2 樣品的制備

取1.3.2節(jié)中3 種大蒜精油質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)的供試菌液，每隔4 h取樣，12 000 r/min離心10 min后吸取1 mL上清液，并在移入相同體積的0.4 mol/L高氯酸后混勻，作為菌液樣品處理液。

1.3.4.3 樣品衍生化

取1.3.4.1節(jié)中的腐胺標(biāo)準(zhǔn)溶液與1.3.4.2節(jié)中的菌液樣品處理液各1 mL，置于5 mL容量瓶中，按照Lu Shiling等[15]的方法進(jìn)行衍生化。經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4.4 UPLC條件

ACQUITY UPLC?HSS T3柱（50 mm×2.1 mm ，1.8 μm），流動(dòng)相A是水，流動(dòng)相B是乙腈；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃。梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，55%流動(dòng)相A；5～12 min，40%流動(dòng)相A；12～15 min，5%流動(dòng)相A；15～20 min，55%流動(dòng)相A。

1.3.5 熏馬腸的制作

處理原料肉（瘦肉占80%、肥肉占20%，將肉塊表面涂抹乙醇，用火灼燒以殺滅表面細(xì)菌，并用紫外燈照射30 min）→修整、切丁→加入經(jīng)滅菌處理的配料（2.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）食鹽、2.0%白糖、0.1%味精、0.2%姜粉、0.1%八角、0.1%胡椒粉、0.15%花椒粉、0.1%五香粉、0.01%亞硝酸鈉、1%煙熏液）→腌制（4 ℃、1 d）→接種供試菌→灌腸→發(fā)酵→成品。

以上步驟均在無菌條件下進(jìn)行，共制作3 組，A組不添加大蒜精油，B組添加質(zhì)量濃度為1/2 MIC的大蒜精油，C組添加質(zhì)量濃度為MIC的大蒜精油，3 組均接入約103CFU/mL德氏乳桿菌。

1.3.6 熏馬腸的發(fā)酵條件

將制作完成的熏馬腸置于恒溫恒濕箱中發(fā)酵，發(fā)酵條件：0～2 d發(fā)酵溫度（18.0±0.5）℃、相對(duì)濕度90%～95%；3～7 d發(fā)酵溫度（12.0±0.5）℃、相對(duì)濕度80%～85%；8～28 d發(fā)酵溫度（10.0±0.5）℃、相對(duì)濕度70%～75%。

1.3.7 大蒜精油對(duì)熏馬腸發(fā)酵的影響

熏馬腸制作完成后分別在第0、3、7、14、21、28天取樣，每次取一根在無菌條件下分裝。采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)菌落總數(shù)，將20 g熏馬腸剪碎置于無菌拍打袋中，加入180 mL無菌生理鹽水，將拍打機(jī)強(qiáng)度調(diào)至4，拍打至樣品完全散開，每組樣品拍打時(shí)間相同，吸取上層菌液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?，于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中均勻涂布。用pH計(jì)測(cè)定上清液的pH值。按照Lu Shiling等[15]的方法制備樣品，按1.3.4.3節(jié)條件衍生化，測(cè)定腐胺積累量[16]。每次取3 個(gè)樣品，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用Origin 8.5軟件繪圖，并用SPSS 23軟件作單因素方差分析，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜精油對(duì)德氏乳桿菌生長(zhǎng)的影響

圖 1 添加不同質(zhì)量濃度大蒜精油48 h內(nèi)德氏乳桿菌OD600 nm的變化Fig. 1 OD600 nm of Lactobacillus delbrueckii during 48 h fermentation with different concentrations of garlic essential oil

如圖1所示，1/2 MIC和MIC大蒜精油組的細(xì)菌OD600nm始終低于不添加大蒜精油組。由此可以看出，在48 h內(nèi)，大蒜精油可有效抑制德氏乳桿菌的生長(zhǎng)，減少菌體數(shù)量，且其質(zhì)量濃度越大抑制作用越強(qiáng)，但并沒有改變供試菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)，只是延緩了其穩(wěn)定期的到來。這是由于大蒜精油疏水性良好，滲透能力強(qiáng)，可均勻分散在細(xì)菌細(xì)胞中，使細(xì)胞內(nèi)容物外泄，從而產(chǎn)生良好的抑菌效果[17]。這與目前報(bào)道的大蒜精油對(duì)其他菌的抑制效果[18-19]類似。

圖 2 添加不同質(zhì)量濃度大蒜精油48 h內(nèi)德氏乳桿菌培養(yǎng)液中pH值的變化Fig. 2 Change in pH during 48 h fermentation of Lactobacillus delbrueckii with different concentrations of garlic essential oil

如圖2所示，德氏乳桿菌在不添加大蒜精油組培養(yǎng)液中開始生長(zhǎng)后，培養(yǎng)液的pH值快速下降，說明其產(chǎn)酸能力強(qiáng)。根據(jù)圖1可知，不添加大蒜精油組中細(xì)菌在24 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)細(xì)菌數(shù)量接近最大值，活菌數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累達(dá)到最高水平，培養(yǎng)液的pH值漸趨穩(wěn)定；但20 h左右pH值下降漸趨緩慢，最終穩(wěn)定在3.8左右，說明培養(yǎng)液中可能有堿性物質(zhì)生成，與大量供試菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)發(fā)生中和，導(dǎo)致pH值漸趨平穩(wěn)。培養(yǎng)液中添加了足量的胍基丁胺與磷酸吡哆醛，隨著供試菌數(shù)量的增加，腐胺也在不斷累積，作為一類堿性物質(zhì)可與供試菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)中和，說明供試菌具有較強(qiáng)的通過AGDI途徑產(chǎn)腐胺的能力。圖2中不添加大蒜精油組的pH值趨于穩(wěn)定后低于另外兩組，這是由于大蒜精油抑制了供試菌的增殖。

2.2 基因表達(dá)分析

如圖3、4所示，以MIC大蒜精油組為對(duì)照，不添加、1/2 MIC大蒜精油組的aguR基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.32、1.28，都不到MIC組的2 倍，說明aguR基因的相對(duì)表達(dá)量受大蒜精油質(zhì)量濃度的影響不明顯，這類似于del Rio等[20]對(duì)NaCl對(duì)乳酸乳球菌影響的研究結(jié)果。而aguB基因的相對(duì)表達(dá)量隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增加極顯著減?。≒＜0.01），其中不添加大蒜精油組的aguB基因相對(duì)表達(dá)量是MIC組的258.03 倍，1/2 MIC組的aguB基因相對(duì)表達(dá)量是MIC組的101.6 倍。說明大蒜精油極顯著抑制了操縱子aguBDAC的轉(zhuǎn)錄（P＜0.01），可能是由于大蒜精油影響了AguR感應(yīng)胍基丁胺及其二聚化。

圖 3 不同大蒜精油質(zhì)量濃度下的aguR基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Effect of garlic essential oil concentration on aguR gene expression

圖 4 不同大蒜精油質(zhì)量濃度下的aguB基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Effect of garlic essential oil concentration on aguB gene expression

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，pH值影響AGDI基因簇的表達(dá)[21]，酸性pH值有利于AguR的構(gòu)造[22]，使信號(hào)到DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)導(dǎo)更加高效，從而激活aguB的信號(hào)后增加操縱子aguBDAC的轉(zhuǎn)錄。添加大蒜精油會(huì)使供試菌生長(zhǎng)過程中產(chǎn)酸量減少，從而不利于AGDI反應(yīng)的發(fā)生。圖4中不添加大蒜精油組的aguB基因相對(duì)表達(dá)量是1/2 MIC組的2.54 倍，是MIC組的258.03 倍；而由圖2可知，處于穩(wěn)定期時(shí)不添加大蒜精油組與1/2 MIC組pH值相差0.4左右，與MIC組相差1.4左右，說明不添加大蒜精油組和MIC組aguB基因相對(duì)表達(dá)量的差異既有大蒜精油對(duì)其的直接影響，又有大蒜精油導(dǎo)致兩組間pH值差異過大繼而影響aguB基因表達(dá)的間接影響。

2.3 純菌體系中腐胺產(chǎn)量分析

圖 5 添加不同質(zhì)量濃度大蒜精油48 h內(nèi)培養(yǎng)液中腐胺積累量Fig. 5 Putresine accumulation in 48 h pure culture with different concentrations of garlic essential oil

如圖5所示，不添加大蒜精油組在12 h內(nèi)未檢測(cè)到腐胺，1/2 MIC組在16 h內(nèi)未檢測(cè)到腐胺，MIC組在24 h內(nèi)未檢測(cè)到腐胺；12～40 h之間不添加大蒜精油組的腐胺積累速率明顯大于1/2 MIC、MIC組；36 h左右時(shí)，3 組培養(yǎng)液中的腐胺積累速率開始減慢。本研究中的德氏乳桿菌具有較強(qiáng)的通過AGDI途徑合成腐胺的能力，不添加大蒜精油和1/2 MIC組在24 h后才開始大量檢測(cè)到腐胺，MIC組則是在28 h左右才檢測(cè)到一定量的腐胺，這可能與del Rio等[23]發(fā)現(xiàn)的胍基丁胺脫亞胺酶的調(diào)節(jié)基因和操縱子aguBDAC中的啟動(dòng)基因只有在微生物生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的過渡期時(shí)才會(huì)被激活有關(guān)。而36 h以后腐胺的產(chǎn)生速率減緩是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中的胍基丁胺被消耗，其濃度和AGDI活性降低，所以腐胺的產(chǎn)生變慢[24]。

大蒜精油可以減少細(xì)菌的生長(zhǎng)，且會(huì)抑制AGDI活性，隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增加，操縱子aguBDAC的轉(zhuǎn)錄受到抑制，所以各組腐胺積累量趨于穩(wěn)定后，不添加大蒜精油組比另外兩組的腐胺積累量都高。也就是說適當(dāng)?shù)靥砑哟笏饩涂捎行б种艫GDI基因簇的表達(dá)，從而減少腐胺的積累。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在生長(zhǎng)期間產(chǎn)酸造成的酸性環(huán)境會(huì)導(dǎo)致更多生物胺的產(chǎn)生[25]，比如酸性環(huán)境有利于糞腸球菌合成酪胺[26]，這是一種耐酸反應(yīng)，供試菌可以通過此反應(yīng)來改善其在酸性環(huán)境中的適應(yīng)性。在最開始的一段時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)液中檢測(cè)不到腐胺，這可能是因?yàn)楣┰嚲粌H在增加數(shù)量，也在適應(yīng)所處環(huán)境。

2.4 熏馬腸發(fā)酵過程中pH值的變化

圖 6 添加不同質(zhì)量濃度大蒜精油后熏馬腸發(fā)酵期間pH值的變化Fig. 6 Change in pH during fermentation of smoked horse meat sausages with different concentrations of garlic essential oil

如圖6所示，新鮮馬腸的初始pH值為5.60～5.64，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，3 組熏馬腸在發(fā)酵前3 d的pH值下降迅速，隨后緩慢下降，到第21天左右開始緩慢回升。0～3 d時(shí)pH值迅速下降主要是由于接種的德氏乳桿菌會(huì)作用于熏馬腸中存在的碳水化合物，使其分解為乳酸或其他有機(jī)酸。發(fā)酵第7～14天時(shí)pH值下降緩慢，是因?yàn)榈蜏貙?dǎo)致熏馬腸中的微生物生長(zhǎng)緩慢，從而使其產(chǎn)酸變慢。第21天時(shí)pH值慢慢上升主要是由于熏馬腸發(fā)酵成熟過程中水分含量不斷減少，且在添加的德氏乳桿菌和少量未滅活的外源菌作用下熏馬腸中有生物胺產(chǎn)生。在第28天時(shí)，3 組樣品的pH值均處于4.60～4.70之間，最終pH值比Lu Shiling等[15]的研究中終產(chǎn)品低，這可能與馬肉品質(zhì)的不同有關(guān)。0～3 d內(nèi)不添加大蒜精油組pH值下降幅度明顯大于添加大蒜精油的兩組，且終產(chǎn)品pH值略低于其他組，但是添加大蒜精油對(duì)熏馬腸發(fā)酵完成后的最終pH值影響并不明顯，類似的研究結(jié)果也曾被Bozkurt[27]報(bào)道。

2.5 熏馬腸發(fā)酵過程中微生物菌落總數(shù)變化

圖 7 添加不同質(zhì)量濃度大蒜精油后熏馬腸發(fā)酵期間的菌落總數(shù)變化Fig. 7 Change in total bacterial count during fermentation of smoked horsemeat sausages with different concentrations of garlic essential oil

據(jù)報(bào)道，乳酸菌在香腸發(fā)酵過程中會(huì)成為優(yōu)勢(shì)菌[28]。如圖7所示，各組菌落總數(shù)在發(fā)酵的前3 d增長(zhǎng)較快，基本達(dá)到最大值，之后的25 d并未發(fā)生明顯變化。各組菌落總數(shù)基本在同一數(shù)量級(jí)，這與原料肉品質(zhì)間的差異有關(guān)，也與各組熏馬腸中菌種活性不同有關(guān)，但是1/2 MIC組與MIC組菌落總數(shù)明顯低于不添加大蒜精油組。到發(fā)酵7 d后，不添加大蒜精油組菌落總數(shù)依舊增加，但另外兩組的菌落總數(shù)明顯減少，且MIC組菌落總數(shù)始終比1/2 MIC組低，表明大蒜精油對(duì)熏馬腸中細(xì)菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。

2.6 熏馬腸發(fā)酵過程中的腐胺積累量分析

圖 8 添加不同質(zhì)量濃度大蒜精油后熏馬腸發(fā)酵期間的腐胺積累量Fig. 8 Putrescine accumulation in smoked horsemeat sausages with different concentrations of garlic essential oil during fermentation

發(fā)酵香腸中存在的腐胺對(duì)消費(fèi)者的健康有潛在的危害，它是產(chǎn)品腐敗的產(chǎn)物[29]。如圖8所示，實(shí)驗(yàn)所使用馬肉的新鮮程度、衛(wèi)生質(zhì)量以及加工和發(fā)酵成熟過程中的微生物種類和數(shù)量的變化等都會(huì)影響腐胺的產(chǎn)生。在熏馬腸發(fā)酵成熟過程中，添加大蒜精油的兩組腐胺含量明顯低于不添加大蒜精油組，1/2 MIC組和MIC組的腐胺積累量分別比不添加大蒜精油組平均減少了30%、50%以上，這是因?yàn)榇笏饩蛯?duì)AGDI具有抑制作用，從細(xì)菌數(shù)量和基因表達(dá)上雙重阻礙了腐胺的產(chǎn)生。

大量研究證明尸胺和腐胺是發(fā)酵肉制品中主要的生物胺[30]，它們除了具有增強(qiáng)產(chǎn)品中組胺和酪胺的毒性作用，還會(huì)與一些胺氧化酶反應(yīng)減弱其降解生物胺的活性。圖8顯示，本研究的3 組熏馬腸在發(fā)酵的0～3 d內(nèi)，腐胺積累量低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)（50 mg/kg）[31]，但不添加大蒜精油組在第7天時(shí)腐胺含量開始超出這個(gè)限量標(biāo)準(zhǔn)，而另外兩組直到成熟結(jié)束也未超過此標(biāo)準(zhǔn)，說明在發(fā)酵香腸中適量地添加大蒜精油有利于其食用安全性。

3 結(jié) 論

研究表明，在培養(yǎng)液中添加大蒜精油能夠明顯抑制德氏乳桿菌的生長(zhǎng)，也能夠明顯抑制pH值的下降，且大蒜精油質(zhì)量濃度越高抑制作用越大。大蒜精油對(duì)AGDI基因簇中的調(diào)節(jié)基因aguR表達(dá)影響不大，但能抑制分解代謝基因aguBDAC中aguB基因的表達(dá)。隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增加，AGDI基因簇中的aguB基因表達(dá)量極顯著減少（P＜0.01），從而使整個(gè)操縱子的轉(zhuǎn)錄受到抑制，即添加大蒜精油能夠通過抑制AGDI途徑的基因表達(dá)來降低供試菌產(chǎn)腐胺的能力。所以在純菌培養(yǎng)體系中，大蒜精油通過抑制德氏乳桿菌的數(shù)量、pH值的下降和aguB基因的表達(dá)來整體抑制腐胺的產(chǎn)生。

在新鮮熏馬腸中添加大蒜精油可明顯減少發(fā)酵過程中的菌落總數(shù)，但對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的最終pH值影響不明顯。大蒜精油能夠抑制產(chǎn)腐胺菌中AGDI基因簇的表達(dá)，從而使熏馬腸發(fā)酵產(chǎn)生的腐胺隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增加明顯減少。在熏馬腸體系中，大蒜精油主要是通過抑制菌落總數(shù)和aguB基因的表達(dá)來減少腐胺的積累。MIC大蒜精油組相比于不添加大蒜精油組腐胺積累量減少了50%以上，因此，在熏馬腸中添加一定量的大蒜精油能夠很好地提升產(chǎn)品的安全性。