樂小鳳,唐永紅,鞠延侖,郭水歡,趙亞蒙,惠竹梅,2,張振文,2,*
(1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院,陜西 楊凌 712100;2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,陜西 楊凌 712100)
果實生長過程中常會出現(xiàn)大小不一的現(xiàn)象,這在蜜桔[1]、桃[2]、荔枝[3]、蘋果[4]和葡萄[5]等水果中已有報道。細胞數(shù)目、細胞大小和細胞間隙是影響果實大小的三要素,內(nèi)源激素參與調(diào)節(jié)細胞分裂和膨大[3]。Cowan等[6]認為小果油梨是由于細胞分裂受到了限制;Moore-Gordon等[7]發(fā)現(xiàn)油梨果實大小與脫落酸含量呈負相關;也有研究表明生長素、赤霉素和細胞分裂素有利于形成大果荔枝[8]。
釀酒葡萄果實發(fā)育的不同步性會導致果實粒徑不同[9]。葡萄果實粒徑也會受激素調(diào)節(jié)、環(huán)境因素以及栽培管理方法等的影響,可以通過改變果皮、果肉和種子所占比例來影響葡萄和葡萄酒的品質(zhì)[10]。葡萄授粉時間的不同會導致先授粉的果粒先膨大,由于具有充足的營養(yǎng)而形成大果粒;后期授粉的果粒膨大時因營養(yǎng)不足而形成小果粒;在葡萄花期之前和坐果期,若前期供水量偏大或者氮肥施用偏多,也會導致果實大、小粒的形成[11]。Holt等[12]的研究發(fā)現(xiàn),‘赤霞珠’果實中酚類物質(zhì)變化不僅取決于果實粒徑的差異,還與自然因素(溫度、降水、土壤濕度等)有關。Roby等[13]的研究發(fā)現(xiàn),灌溉處理對葡萄果皮總花色苷和種子單寧含量的影響比粒徑的影響大。果實粒徑與葡萄酒品質(zhì)并不是簡單的線性關系[12],很難剝離環(huán)境因素研究粒徑本身對葡萄果實品質(zhì)的影響。因此,本實驗選取寧夏玉泉營地區(qū)的‘美樂’和‘蛇龍珠’葡萄,研究在相同環(huán)境和同一栽培管理技術下自然形成的不同果實粒徑的葡萄品質(zhì)間的差異,以期為釀造過程中的粒選工藝提供理論指導。
本實驗連續(xù)兩年以寧夏永寧縣玉泉營鎮(zhèn)的‘美樂’和‘蛇龍珠’葡萄為試材,于2014、2015年分別開展實驗。
氫氧化鈉、硫酸銨、甲基纖維素、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰均為國產(chǎn)分析純;甲醇、鹽酸、乙腈、甲醇均為國產(chǎn)色譜純;所有花色苷單體標樣和單體酚標準品(均為色譜純) 美國Sigma公司。
高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀、UV-1700紫外-可見分光光度計 美國Agilent公司;5804R低溫冷凍離心機德國Eppendorf公司;超聲波振蕩器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;CentriVap 78100-40離心濃縮系統(tǒng) 美國LABCONCO公司;FA2004型電子天平 上海精科實業(yè)有限公司。
1.3.1 采樣及果實粒徑分級
當葡萄達到商業(yè)成熟度時,分別隨機采集5 kg樣品,用冰袋運回實驗室,貼近果蒂處用剪刀逐粒剪下,-40 ℃冰箱保存。用14、12 mm圓孔分樣篩將‘美樂’果粒分為大于14 mm(大果粒,L)、12~14 mm(中等果粒,M)、小于12 mm(小果粒,S)3 個粒徑等級;‘蛇龍珠’果粒用15、14 mm圓孔篩分為大于15 mm(大果粒,L1)、14~15 mm(中等果粒,M1)、小于14 mm(小果粒,S1)3 個等級;每次隨機選取900 粒,進行3 次生物學重復,統(tǒng)計各粒徑范圍果粒所占比例。
1.3.2 果實基本指標的測定
各粒徑范圍的果粒隨機選取100 粒稱質(zhì)量,剝皮、取籽,并稱其果皮鮮質(zhì)量、種子質(zhì)量、單果粒種子數(shù)、單粒種子干質(zhì)量,從而計算皮/果質(zhì)量比(果皮鮮質(zhì)量/果粒鮮質(zhì)量×100)、種/果質(zhì)量比(種子鮮質(zhì)量/果粒鮮質(zhì)量×100)。同時參照唐永紅等[5]的方法,隨機選取100 粒葡萄,揉碎過濾取汁,測定果汁的可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)(手持糖度計法)、可滴定酸質(zhì)量濃度(NaOH滴定法)和pH值(pH計法)。同時,隨機選取200 粒果實用于果皮中總酚[14]、單寧[15]、總花色苷[16]含量的測定。
1.3.3 果皮花色苷單體含量的測定
每個樣品隨機選取100 粒葡萄,在冷凍狀態(tài)下剝皮,將果皮液氮速凍后打粉,置于冷凍干燥機干燥24 h后,稱取0.5 g葡萄果皮干粉于離心管中,加入10 mL體積分數(shù)2%甲酸-甲醇溶液,避光超聲10 min后25 ℃搖床振蕩提取30 min,4 ℃、8 000 r/min離心5 min,取上清液,重復4 次。合并上清液于100 mL圓底燒瓶,用旋轉蒸發(fā)儀31 ℃蒸干,殘渣用流動相(V(流動相A)∶V(流動相B)=9∶1)重新溶解并定容至10 mL,-40 ℃下保存?zhèn)溆?,樣品進樣前用0.45 μm濾膜過濾[17]。HPLC條件參照王華等[18]的方法。
1.3.4 果皮單體酚含量的測定
取1.0 g待測葡萄果皮干粉(2015年)、5 mL蒸餾水和45 mL乙酸乙酯于三角瓶中,在25 ℃、150 r/min搖床中避光提取30 min,收集上清液于250 mL圓底燒瓶中,再重復加入45 mL乙酸乙酯提取3 次,合并4 次上清液并用旋轉蒸發(fā)儀30 ℃蒸干,殘渣用甲醇溶解并定容至2 mL,-40 ℃下保存待測,進樣前用0.45 μm濾膜過濾[17]。HPLC條件參照成宇峰等[19]的方法。
采用Excel軟件處理數(shù)據(jù),利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和多重比較(Duncan新復極差法),P<0.05表示差異顯著,并用Excel軟件作圖。
圖 1 葡萄果實粒徑分布Fig. 1 Berry size distribution
如圖1所示,‘美樂’連續(xù)兩年的粒徑分布均表現(xiàn)為中等果粒>小果粒>大果粒,且3 個粒徑間差異顯著,中等果粒所占比例都大于50%,大果粒都少于10%?!啐堉椤B續(xù)兩年的中等果粒所占比例均顯著高于其他兩種粒徑,2014年小果粒所占比例顯著高于大果粒,2015年則是大果粒所占比例顯著高于小果粒。
如表1所示,‘美樂’果實2014年的可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)隨粒徑的增大而降低,但2015年表現(xiàn)為中等果粒>大果粒>小果粒,且3 個粒徑等級間差異顯著;2014年可滴定酸質(zhì)量濃度隨粒徑的減小而降低,而2015年則表現(xiàn)出相反的趨勢,中、小果??傻味ㄋ豳|(zhì)量濃度顯著高于大果粒。‘蛇龍珠’果實2014年的可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)變化情況與‘美樂’一致,也隨著粒徑的增大而降低,2015年也表現(xiàn)為中等果粒顯著高于大、小果粒;2014年各粒徑果粒間可滴定酸質(zhì)量濃度無顯著性差異,而2015年表現(xiàn)為大果粒>小果粒>中等果粒,且三者差異顯著。2014年‘美樂’大果粒的pH值顯著低于中、小果粒;2015年則表現(xiàn)為顯著高于中、小果粒?!啐堉椤麑嵾B續(xù)兩年的pH值都表現(xiàn)為中等果粒最低。
表 1 果實粒徑與基本品質(zhì)指標Table 1 Berry size and quality indicators
表 2 果實粒徑與物理特性Table 2 Berry size and physical characteristics
如表2所示,2014、2015年‘美樂’的皮/果質(zhì)量比均隨粒徑的減小而增大;種/果質(zhì)量比、單粒種子質(zhì)量和單果粒種子數(shù)均表現(xiàn)為隨粒徑的減小而減小?!啐堉椤钠?果質(zhì)量比在2014年表現(xiàn)為在小果粒(15.07%)中最高,2015年則為中等果粒(8.73%)最高;兩年中種/果質(zhì)量比和單果粒種子數(shù)都表現(xiàn)為隨粒徑的減小而減小;單粒種子質(zhì)量表現(xiàn)為大果粒顯著高于中等果粒和小果粒。
2.4.1 不同果實粒徑對酚類物質(zhì)含量的影響
由圖2可看出,不同粒徑間的酚類物質(zhì)含量均差異顯著。2014年,‘美樂’果實的總酚和總花色苷含量均表現(xiàn)為小果粒>大果粒>中等果粒;2015年,‘美樂’果實的總酚和花色苷含量則為中等果粒>小果粒>大果粒;兩個年份‘美樂’果實的單寧含量均為小果粒顯著高于大、中果粒。綜合兩個年份可知,‘美樂’小果粒和中等果粒中酚類物質(zhì)含量較高。
圖 2 不同粒徑果粒的酚類物質(zhì)含量Fig. 2 Phenolic contents of grapes of different sizes
2014年,‘蛇龍珠’果實的總酚和總花色苷含量均表現(xiàn)為大果粒>小果粒>中等果粒;2015年,‘蛇龍珠’果實的總酚和總花色苷含量均表現(xiàn)為中等果粒>大果粒>小果粒;兩個年份果實單寧含量隨粒徑的減小而降低。綜合兩個年份結果可知,‘蛇龍珠’大果粒和中等果粒中酚類物質(zhì)含量較高。
2.4.2 不同果實粒徑對花色苷單體含量的影響
由表3可知,‘美樂’和‘蛇龍珠’葡萄果皮中都檢測到9 種花色苷單體物質(zhì),包括5 種非?;ㄉ蘸? 種酰化花色苷,其含量受年份影響較大。2014年‘美樂’果實中的非?;ㄉ湛偭侩S粒徑的增大而減少,除二甲花翠素葡萄糖苷表現(xiàn)為中等果粒含量較高外,其他非?;ㄉ蘸慷急憩F(xiàn)為小果粒>中等果粒>大果粒;?;ㄉ湛偭縿t為中等果粒(190.63 mg/kg)較高,大果粒(147.96 mg/kg)較低,除甲基花青素香豆?;咸烟擒赵谛」V泻枯^高外,其他酰化花色苷單體均表現(xiàn)為中等果粒中含量較高;就花色苷總量而言,小果粒和中等果粒間差異不顯著,但均顯著高于大果粒。2015年‘美樂’果實中的非?;ㄉ湛偭孔兓厔菖c2014年一致,也表現(xiàn)為小果粒中最高,大果粒中最低,除甲基花翠素葡萄糖苷和甲基花青素香豆酰化葡萄糖苷在中等果粒中含量較高外,其他非酰化單體花色苷均為小果粒中含量較高;酰化花色苷總量則表現(xiàn)為中等果粒(280.83 mg/kg)中最高,大果粒(102.57 mg/kg)中最低;花色苷單體總量表現(xiàn)為中等果粒(1 415.90 mg/kg)顯著高于小果粒(1 285.91 mg/kg)和大果粒(500.61 mg/kg)。兩年中同一個粒徑范圍的‘美樂’果?;ㄉ諉误w含量變化很大,大果粒2015年所有花色苷單體含量均低于2014年;中等果粒2015年的非酰化花色苷總量相比2014年降低了15.9%,但酰化花色苷總量相比2014年增加了47.3%,花色苷單體總量相比2014年增加了1.3%;小果粒2015年花色苷單體總量相比于2014年降低了8%。綜合兩年數(shù)據(jù)可知,‘美樂’中等果粒葡萄皮中花色苷單體總量最高。
表 3 不同粒徑果實花色苷單體含量Table 3 Contents of anthocyanin monomers in grapes of different sizes
2014年‘蛇龍珠’小果粒中所有花色苷單體含量均高于大果粒和中等果粒,小果粒花色苷總量(1 121.04 mg/kg)也顯著高于大(794.68 mg/kg)、中(720.95 mg/kg)果粒,非?;ㄉ蘸王;ㄉ湛偭烤憩F(xiàn)為小果粒顯著高于大果粒和中等果粒。2015年3 個粒徑范圍各花色苷單體含量均低于2014年,花色苷單體總量表現(xiàn)為大果粒顯著高于中等果粒和小果粒,3 個粒徑范圍相比2014年分別降低了54.9%、50.4%和79.1%,非?;ㄉ蘸王;ㄉ湛偭烤憩F(xiàn)為大果粒顯著高于中等果粒和小果粒?!啐堉椤ㄉ諉误w含量受年份影響較大。
2.4.3 不同果實粒徑對單體酚含量的影響
表 4 2015年不同粒徑果實單體酚含量Table 4 Contents of monomeric phenolic compounds in grapes of different sizes harvested in 2015
由表4可以看出,2015年‘美樂’大、中、小果粒中分別檢測出26、24、24 種單體酚物質(zhì)。中等果粒單體酚總量最高(29 763.27 μg/kg),略高于小果粒(29 569.68 μg/kg),顯著高于大果粒(21 549.74 μg/kg)。原兒茶酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯在大果粒中含量較高,僅小果粒中檢測出香草酸。小果粒中羥基苯甲酸類總量(52.14 μg/kg)顯著高于大果粒(45.96 μg/kg)和中等果粒(23.57 μg/kg),大果粒中的所有黃烷醇類物質(zhì)含量及總量均明顯高于中、小果粒。大部分黃酮醇類物質(zhì)在中等果粒和小果粒中含量較高,中等果粒總量最高,略高于小果粒,顯著高于大果粒。
2015年‘蛇龍珠’大、中、小果粒中分別檢測到22、24、24 種單體酚物質(zhì),單體酚總量在大果粒中最高(13 308.24 μg/kg),其次是小果粒(12 632.12 μg/kg),中等果粒中最低(11 190.02 μg/kg)。原兒茶酸和香草酸在中等果粒中含量最高,表沒食子兒茶素沒食子酸酯在小果粒中含量最高,中等果粒的羥基苯甲酸類物質(zhì)總量(44.63 μg/kg)顯著高于大果粒(30.00 μg/kg)和小果粒(40.37 μg/kg)。棓兒茶素和兒茶素在小果粒中含量較高,表棓兒茶素和表兒茶素含量在中等果粒中含量較高,其他黃烷醇類物質(zhì)在大果粒中含量較高,大果粒中黃烷醇類物質(zhì)總量(2 202.96 μg/kg)顯著高于中等果粒(1 040.49 μg/kg)和小果粒(1 979.44 μg/kg)。槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、槲皮素-3-O-半乳糖苷、楊梅酮和丁香亭在小果粒中含量較高,丁香亭-半乳糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷在中等果粒中含量較高,其他檢出的黃酮醇類物質(zhì)在大果粒中含量較高,大果粒中黃酮醇類物質(zhì)總量(11 075.29 μg/kg)顯著高于中等果粒(10 104.90 μg/kg)和小果粒(10 612.31 μg/kg)。
圖 3 不同粒徑果粒的主成分得分散點圖Fig. 3 Scatter plots of the fi rst two principal components for quality indicators of grapes of different berry sizes
用SPSS 19.0軟件對不同果實粒徑葡萄的可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)、可滴定酸質(zhì)量濃度、pH值和總酚、總花色苷、單寧以及花色苷單體的含量進行主成分分析。由圖3可知,2014年主成分1、2的累計貢獻率為86.379%,第1主成分貢獻率為52.441%,主要反映了二甲花翠素香豆?;咸烟擒?、總酚、單寧和花色苷單體含量等的變異情況;第2主成分貢獻率為33.938%,主要反映了花翠素葡萄糖苷和3’-甲基花翠素葡萄糖苷含量等的變異信息。不同粒徑‘美樂’和‘蛇龍珠’葡萄果實分布在不同的區(qū)域:不同粒徑的‘美樂’葡萄都分布在第1主成分的負方向,小果粒和中等果粒的‘美樂’葡萄距離較近,主要受可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)和花青素葡萄糖苷、甲基花青素葡萄糖苷、甲基花青素乙?;咸烟擒蘸康挠绊?;不同粒徑的‘蛇龍珠’葡萄分布在第1主成分的正方向,小果粒的‘蛇龍珠’葡萄主要受pH值和甲基花青素香豆?;咸烟擒盏然ㄉ諉误w(Pn、Pt-co、Mv-ac)含量的影響。2015年主成分1、2的累計貢獻率為85.240%,第1主成分貢獻率為68.814%,主要反映了單寧、可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)、總酚含量和3’-甲基花翠素葡萄糖苷等花色苷單體(Mv、Dp、Mv-ac、Pt、Cy、Pn-ac)含量的變異信息;第2主成分貢獻率為16.426%。不同粒徑的‘美樂’葡萄分散于不同區(qū)域,且差異較大:小果粒和中等果?!罉贰植荚诘?主成分的正方向,中等果粒主要受花色苷單體、總酚含量和可滴定酸質(zhì)量濃度的影響;小果粒主要受一些花色苷單體(Pt、Dp、Cy、Pn-ac)含量的影響;大果粒的‘美樂’分布在第1主成分的負方向;不同粒徑的‘蛇龍珠’葡萄分布在第2主成分的正方向,主要受單寧含量和pH值的影響??偟貋碚f,不同葡萄品種和同一葡萄品種不同粒徑間品質(zhì)有差異,分布在不同區(qū)域,且差異在不同年份間不盡相同。
釀酒葡萄果實粒徑分布受外界土壤、地勢和微環(huán)境等環(huán)境因素的影響。Rolle等[20]的研究表明,‘玫瑰香’葡萄的粒徑分布為正態(tài)分布,即中等果粒所占比例最高;Gil等[21]的研究表明‘赤霞珠’葡萄中等果粒所占比例最高,本實驗中‘美樂’和‘蛇龍珠’葡萄連續(xù)兩年均為中等果粒比例較高,與前人研究結果一致。葡萄的皮/果質(zhì)量比受外界環(huán)境影響較大,Roby等[22]的研究表明灌水量較低時,小果粒中皮/果質(zhì)量比高;Barbagallo等[23]的研究表明皮/果質(zhì)量比與粒徑間沒有顯著的相關性,本實驗中‘美樂’葡萄的皮/果質(zhì)量比隨粒徑的減小而增大,但‘蛇龍珠’葡萄的皮/果質(zhì)量比與粒徑無此變化趨勢,這可能與葡萄品種或粒徑范圍劃分有關。‘美樂’和‘蛇龍珠’葡萄的種/果質(zhì)量比隨果實粒徑的增大而增加,Barbagallo等[23]的研究也體現(xiàn)這一規(guī)律。單果粒種子數(shù)隨果實粒徑的增大而增加,和前人研究[24]一致。2014年‘美樂’和‘蛇龍珠’的可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)均隨著果實粒徑的增大而降低,相關研究也表明小果粒的葡萄中可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)較高[22,25],2015年則表現(xiàn)為中等果粒質(zhì)量分數(shù)較高。本實驗中葡萄果實的可滴定酸質(zhì)量濃度和pH值與果實粒徑無明顯的相關性,與前人研究結果[23]類似。
釀酒葡萄果實中酚類物質(zhì)主要存在于果皮和種子中,酚類物質(zhì)對葡萄酒的貢獻取決于外界環(huán)境因素、栽培管理措施及發(fā)酵浸漬過程[26-27]。本實驗中‘美樂’果實的單寧含量均為小果粒中最高;總酚和總花色苷含量2014年為小果粒>大果粒>中等果粒,2015年則為中等果粒>小果粒>大果粒?!啐堉椤麑崋螌幒侩S粒徑的增大而增加,且在大果粒中最高;2014年總酚和總花色苷含量為大果粒>小果粒>中等果粒,2015年則為中等果粒>大果粒>小果粒。Romerocascales等[28]的研究發(fā)現(xiàn)‘慕合懷特’(‘Mourvèdre’)葡萄的花色苷和單寧濃度為小果粒比大果粒更高。Barbagallo等[23]的研究表明小果粒的‘玫瑰香’葡萄花色苷總量較高。Matthews等[26]發(fā)現(xiàn)葡萄果皮中約70%酚類物質(zhì)含量的變化都可以由果皮相對質(zhì)量的變化來解釋,因為小果粒中皮/果質(zhì)量比較高,所以其花色苷總量較高。Roby等[22]也發(fā)現(xiàn)果皮中單寧和花色苷濃度與果皮的相對質(zhì)量即皮/果質(zhì)量比間呈線性正相關。本實驗中的‘蛇龍珠’葡萄的皮/果質(zhì)量比與粒徑不相關,但‘美樂’葡萄的皮/果質(zhì)量比隨粒徑的減小而增大,可以解釋葡萄酚類物質(zhì)含量與粒徑的關系,但其受年份影響也較大。Roby等[22]的研究還表明,果皮中單寧濃度隨果粒的增大有略微減小的趨勢,但在中等果粒范圍內(nèi)相對穩(wěn)定,果皮中花色苷濃度隨果實粒徑的增大而減小,但中等粒徑范圍果實花色苷濃度有波動,且不是呈嚴格的線性關系。由于粒徑劃分范圍的不同,可能會出現(xiàn)本研究中‘蛇龍珠’葡萄大、中果粒酚類物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)較高的現(xiàn)象。
本實驗中‘美樂’和‘蛇龍珠’葡萄都檢測到9 種花色苷單體物質(zhì),包括5 種非?;ㄉ蘸? 種?;ㄉ?,不同粒徑范圍含量差異比較明顯,同一個粒徑范圍的果粒連續(xù)兩年的花色苷單體含量差異也很大。實驗中發(fā)現(xiàn)果實粒徑對其花色苷單體組分并沒有顯著影響,與前人的結論[20]一致。就花色苷單體總量而言,‘美樂’葡萄連續(xù)兩年都表現(xiàn)為中等果粒中較高;‘蛇龍珠’葡萄2014年非?;ㄉ蘸王;ㄉ湛偭烤憩F(xiàn)為小果粒顯著高于大果粒和中等果粒,2015年則為大果粒顯著高于中等果粒和小果粒。本實驗中‘美樂’和‘蛇龍珠’葡萄的花色苷單體含量受年份影響較大。
單體酚是指除花色苷以外的酚類,主要包括酚酸類(苯甲酸類、肉桂酸類)、黃酮醇類(黃烷酮類、黃酮醇類、黃酮類)、黃烷-3-醇類,以及一些特殊的酚類物質(zhì)等。本實驗中主要檢測了葡萄果實中羥基苯甲酸類、黃烷醇類以及黃酮醇類物質(zhì)含量。Rolle等[20]的研究表明‘玫瑰香’總類黃酮和原花青素含量在小果粒中較高,Baiano等[29]也發(fā)現(xiàn)小果粒中單體酚總量較高。黃酮醇類物質(zhì)占單體酚總量的80%以上,其含量的高低基本可以決定單體酚總量的高低。黃酮醇具有保護葡萄免受紫外線傷害、清除自由基的功能。本研究中,中等果粒‘美樂’葡萄的黃酮醇類物質(zhì)總量略高于小果粒,顯著高于大果粒;‘蛇龍珠’葡萄黃酮醇類物質(zhì)總量在大果粒中較高,與前人的結果不完全一致,可能由于對果實粒徑的定義不同所致。
從本研究中可看出,不同粒徑的葡萄果實品質(zhì)有差異,且受年份影響較大?!罉贰咸训幕ㄉ蘸蛦误w酚等酚類物質(zhì)含量表現(xiàn)為中等果粒較高,‘蛇龍珠’葡萄則為大果粒中較高。本研究結果為釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的粒選工藝提供理論依據(jù)。