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    支氣管哮喘患兒白介素1受體1基因RS1041973及RS10208293位點單核苷酸多態(tài)性觀察

    2019-04-02 06:37:08徐哲劉亞軍鄢程程丁藝何婷婷張福高清川
    山東醫(yī)藥 2019年6期
    關鍵詞:等位基因基因型細胞因子

    徐哲,劉亞軍, 鄢程程,丁藝,何婷婷,張福,高清川

    (廣元市中心醫(yī)院,四川廣元628000)

    據(jù)統(tǒng)計,全球的兒童哮喘發(fā)病率逐年上升[1]。根據(jù)2014年全球哮喘防治創(chuàng)議委員會調(diào)查研究表明[2],≤5歲兒童哮喘的病因復雜,其發(fā)病的病理生理學機制亦尚未徹底清楚,可能與內(nèi)分泌因素、神經(jīng)、免疫精神和遺傳學背景等密切相關。目前的觀點[3]是遺傳和環(huán)境因素相互作用共同導致哮喘的發(fā)展和演變。國外早期的全基因組關聯(lián)研究(GWAS)[4]已確定多個染色體位點與哮喘相關,且多項關于候選基因變異與哮喘風險的相關性研究[5]提出了多種易感基因。最新GWAS研究[6]發(fā)現(xiàn),白介素1受體1(Interleukin 1 receptor-like 1, IL1RL1)基因是哮喘的易感基因。進一步研究[7]發(fā)現(xiàn),漢族哮喘患者血清L1RL1水平升高,且該易感基因的RS1558641位點與過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展有關。我們前期基于Hapmap數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得的IL1RL1基因組遺傳變異資料,采用Haploview軟件確定其多態(tài)位點的分布頻率,利用Tagger功能,按照在中國人群中最下等位基因頻率>5%,并且與區(qū)段內(nèi)其他單核苷酸多態(tài)性(SNP)的連鎖不平衡系數(shù)均>0.8的原則,最終篩選出RS1041973、RS1020893位點可能與過敏性哮喘有關。但嬰幼兒哮喘與IL1RL1基因中RS1041973、RS1020893位點的相關性研究較少。我們觀察了支氣管哮喘患兒IL1RL1基因RS1041973、RS1020893位點的SNP,旨在為嬰幼兒支氣管哮喘的病理生理學機制提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 隨機選取2012年1月~2015年1月在廣元市中心醫(yī)院兒科門診及住院確診為支氣管哮喘[8]的患兒86例為哮喘組,其中男49 例,女37例,年齡5月~3(1.49 ± 0.70) 歲。同時隨機選取同時體檢的健康兒童100例為對照組,其中男50例,女50例,年齡 3 月~3 (1.52 ± 0.85)歲。兩組年齡、性別比例具有可比性。兩組納入對象均排除既往有心肺、肝病或腎病疾患,過敏性疾患及其他變態(tài)反應性疾患史,免疫性疾病史和慢性疾病史,近四周無感染及服藥史。本研究通過廣元市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準,納入患兒家長均簽署知情同意書。

    1.2 兩組IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點基因型及等位基因分析方法 抽取兩組空腹靜脈血2 mL,3 000 r/min離心5 min。采用天根血液DNA提取試劑盒(DP348),參照試劑盒說明書,提取血液DNA,-70 ℃保存?zhèn)溆?。利用探針、引物找到其IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點并對其進行擴增,采用ARMS-qPCR法對其基因位點行基因分型檢測。設計引物、探針及利用Primer Premer6軟件設計擴增引物由上海捷瑞生物公司合成,所有引物及探針可見表1、2。

    表1 IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點基本信息、引物及探針序列

    表2 IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點測序引物序列

    熒光定量PCR結合特異性ARMS引物和探針,檢測IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點的基因型以及等位基因的表達情況。熒光定量PCR 反應條件為:95 ℃ 3 min, 40個循環(huán):94℃ 10 s,60 ℃ 40 s。RS1041973 位點A/C基因型測序結果包括AA、AC、CC三種基因型,RS10208293位點A/G基因型測序結果包括AA、AG、GG三個基因型。

    1.3 兩組血清IL1RL1、IgE檢測 采用ELISA法。抽取兩組空腹靜脈血2 mL,3 000 r/min離心5 min,取血清。人血IL1RL1定量免疫試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司,參照其試劑盒說明檢測兩組血清IL1RL1。人IgE定量免疫試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司,參照其試劑盒說明檢測兩組血清IgE。

    2 結果

    哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點基因型AA、AC、CC的分布頻率分別為3.5%(3/86)、23.3%(20/86)、73.2%(63/86),等位基因A、C的分布頻率分別為15.2%(26/172)、84.8%(146/172);對照組分別為8.0%(8/100)、26.0%(26/100)、66.0%(66/100)、21%(42/200)、79%(158/200);兩組AC、CC基因型分布頻率及等位基因A、C的分布頻率差異存在統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與RS1041973位點基因型AA基因人群比較,RS1041973位點AC、CC基因型的個體患哮喘的風險性增加(校正OR=1.769,2.212;95%CI:0.47~6.655,0.637~7.687);且攜帶C等位基因的個體患哮喘的危險度是A基因的1.506倍(95%CI:0.726~3.126,P<0.05)。

    哮喘組IL1RL1基因RS10208293位點基因型AA、AG、GG的分布頻率分別為4.6%(4/86)、25.6%(22/86)、69.8%(60/86),等位基因A、G的分布頻率分別為17.4%(30/172)、82.6%(142/172);對照組分別為7.0%(7/100)、29.0%(29/100)、64.0%(64/100)、21.5%(43/200)、78.5%(157/200);兩組AG、GG基因型分布頻率及等位基因A、G的分布頻率差異存在統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與RS10208293位點基因型AA基因人群比較,RS10208293位點AG、GG基因型的個體患哮喘的風險性增加(校正OR=1.255,1.531;95%CI:0.355~-4.442,0.463~ 5.067);且攜帶G等位基因的個體患哮喘的危險度是A基因的1.36倍(95%CI:0.673~2.749,P<0.05)。

    哮喘組、對照組血清IL1R1分別為(78.32±53.32)、(67.36 ±36.73)ng/mL(P<0.05);哮喘組、對照組血清IgE分別為(140.87±65.32)、(87.84±45.22)ng/mL(P<0.05)。

    3 討論

    炎癥免疫反應在支氣管哮喘發(fā)病中的作用機制一直是備受關注的焦點。研究[9]發(fā)現(xiàn),Th2細胞在支氣管哮喘的炎癥反應過程中發(fā)揮了及其重要的作用。IL1RL1基因定位于2號染色體上,最早從BALB/c-3T3細胞系中得到IL1RL1基因,其結構與IL-1受體(IL-1R)相似,具有 Toll/IL-1R的結構域,同時主要表達于肺動脈內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞、肥大細胞、T淋巴細胞和TH2細胞。以往研究[10]證實在不同人群中 IL1RL1 基因與哮喘的發(fā)病風險相關。

    IL1RL1 基因編碼位于 TH2 細胞和調(diào)節(jié)性T 細胞受體。IL1RL1可特異性識別并結合IL-33,兩者相互作用,借助IL-1 輔助受體蛋白( IL-1RAcP)而形成IL-33/ IL1RL1復合物[11]。胞膜上IL1RL1和 IL-1RAcP 可組合形成異二聚體,通過與IL-33 結合,將信號轉(zhuǎn)導至胞內(nèi)并激活下游絲裂原活化蛋白激酶( MAPKK) ,導致 NF-κB 從復合物中釋放出來,最終激活Th2 細胞因子,促Th2細胞因子過表達,啟動炎癥反應的發(fā)生[13]。本研究結果發(fā)現(xiàn),在支氣管哮喘患兒中IL-33的過表達和IL1RL1過表達同時存在,進一步證實了IL-33/ IL1RL1復合物激活的信號通路在哮喘中具有舉足輕重的作用。IL-33/IL1RL1通路多態(tài)性與哮喘表型相關聯(lián)。以上研究結果均提示,阻斷IL-33/IL1RL1 信號通路可減少TH2細胞因子的激活,減輕炎癥反應以達到治療哮喘的效果。

    支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥,TH2細胞因子的活化是其病理生理學基礎[13],IL-33/ IL1RL1復合物可以將信號轉(zhuǎn)導至胞內(nèi)激活MAPKK,導致NF-κB的釋放,激活Th2 細胞因子,促進Th2細胞因子過表達,從而導致Th2高表達,Th2高表達型通常表現(xiàn)為血清IgE的增高[14],從而導致炎癥反應的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),哮喘組血清IL1RL1和IgE的水平明顯高于對照組,提示IL1RL1表達與血清IgE表達可能具有一定的關系。

    RS1041973 位點位于IL1RL1基因的三號外顯子上,為非同義突變,其突變可導致細胞膜外部區(qū)域的IL1RL1蛋白特定位點的谷氨酸突變?yōu)楸彼?,其結果是使負電荷的氨基酸突變?yōu)橹行园被?,從而導致在細胞外免疫球蛋白樣結構域的構象改變[15]。RS1041973位點A>C,在哮喘患兒中分布增多,且IL1RL1蛋白的血清含量明顯增多,同樣也說明該位點的突變可能與IL1RL1基因的過表達相關,過度激活IL-33/ IL1RL1信號通路,導致呼吸道的過敏反應,進而引發(fā)嬰幼兒的哮喘發(fā)作。RS10208293位點位于IL1RL1基因的內(nèi)含子區(qū)域,實驗研究發(fā)現(xiàn)該位點的A>G,也與IL1RL1表達量增高相關,推測可能的原因為該位點與調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄翻譯的位點存在連鎖效應,但進一步的分子機制有待研究。

    本研究結果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點基因型AC、CC的分布頻率高。RS1041973的基因型位點中的AA、AC、CC這三種基因型,AA基因型不增加哮喘發(fā)生危險,AA基因型的OR值為1,而AC、CC基因型均可增加哮喘發(fā)生的危險性,在RS1041973的等位基因型A和C中,A等位基因不能使哮喘的患病風險增高,A等位基因的OR值為1,而C等位基因可能提示患病風險增高,說明與RS1041973位點基因型AA基因人群比較,RS1041973位點AC、CC基因型的個體患哮喘的風險性增加;且攜帶C等位基因的個體患哮喘的危險度是A基因的1.506倍。與對照組比較,哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點基因型AG、GG的分布頻率高。在RS102082933的基因型位點中的AA、AG、GG這三種基因型,AA基因型不能增加哮喘發(fā)生的危險性,AA基因型的OR值為1,而 AG 和GG 基因型均能增加哮喘發(fā)生的危險性,RS102082933位點等位基因型A和G中,A等位基因不能使哮喘的患病風險增高,A等位基因的OR值為1,而G等位基因可能提示患病風險增高,提示與RS10208293位點基因型AA基因人群比較,RS10208293位點AG、GG基因型的個體患哮喘的風險性增加;且攜帶G等位基因的個體患哮喘的危險度是A基因的1.36倍。

    綜上所述,支氣管哮喘患兒IL1RL1基因RS1041973位點基因型AC、CC的分布頻率高,C等位基因突變頻率高;RS10208293位點基因型AG、GG的分布頻率高,G等位基因突變頻率較高。IL1RL1基因RS1041973位點A/C的C等位基因、RS10208293位點A/G的G等位基因可能與支氣管哮喘的易感性有關。支氣管哮喘患兒血清IL1RL1、IgE均水平增高,IL1RL1、IgE可能通過過度激活TH2細胞因子,在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

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