宮頸鱗癌組織中P21活化的激酶1和Sprouty相關(guān)EVH1域蛋白1表達(dá)觀察

王曉，申倩倩，王焱，張俊俊

(1河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003；2河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1,2]。現(xiàn)已證實(shí)高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)病的高危因素，目前已知HPV病毒有120多個(gè)型別，其中與宮頸癌發(fā)展相關(guān)的高危型HPV有18種，HPV感染主要影響轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、基因組的復(fù)制及宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，且HPV感染可影響多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)[3]。P21活化的激酶(PAK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)上游調(diào)控因子，參與細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架系統(tǒng)重排、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移[4]。已有學(xué)者[5]研究證實(shí)PAK在肺癌、胃癌、食管癌等多腫瘤組織中呈高表達(dá)。Sprouty相關(guān)EVH1域蛋白(Spred)可抑制細(xì)胞分化，對(duì)多種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的Ras-ERK途徑均有抑制作用；Ras-MAPK途徑在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、增殖和分化過(guò)程中起重要作用，并且該途徑與多種腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展關(guān)系密切[6]。目前關(guān)于宮頸癌組織中PAK1、Spred1表達(dá)變化相關(guān)報(bào)道較少。我們檢測(cè)了宮頸鱗癌組織PAK1、Spred1表達(dá)，并分析其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月～2015年12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)及活檢的宮頸組織標(biāo)本154例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前3月內(nèi)未接收藥物治療；②術(shù)前均未接受放療、新輔助化療和中藥治療；③臨床病理資料完整、病例信息完整者。154例患者中年齡24～68歲，中位年齡50歲；高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染80例；其中宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)(CINⅠ)、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ級(jí)(CINⅡ～Ⅲ)患者分別為24、31例，經(jīng)組織病理檢查確診為宮頸鱗癌患者59例；59例宮頸鱗癌患者中分期(采用2009年FIGO臨床分期)為Ⅰ～Ⅱ期48例、Ⅲ～Ⅳ期11例，分化程度為中-低分化22例、高分化37 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例；因非宮頸疾病行全子宮全切的正常宮頸組織標(biāo)本40例為對(duì)照，中位年齡49歲。不同宮頸病變程度納入者年齡具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，納入者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與方法 兔抗人PAK1多克隆抗體bs-2277R、兔抗人Spred1多克隆抗體bs-17685R、 DAB 顯色試劑盒(試劑均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。兔抗人PAK1多克隆抗體1:50倍稀釋、兔抗人Spred1多克隆抗體1∶75倍稀釋)；采用免疫組化法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，陰性對(duì)照一抗使用PBS緩沖液替代，用已知陽(yáng)性病理切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 宮頸鱗癌組織PAK1及Spred1檢測(cè) 采用免疫組化法。所有操作均要嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用雙盲法請(qǐng)2位專(zhuān)業(yè)病理科醫(yī)師閱片。PAK1及Spred1均定位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。按著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)綜合計(jì)算[7]，著色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；每個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)觀察10個(gè)視野，取各視野中陽(yáng)性數(shù)平均值作為最終陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陰性為0分，<10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相乘結(jié)果作為最終評(píng)分，≤3分判定為陰性，>3分判定為陽(yáng)性。計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率(陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)×100%)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料用%表示，比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法統(tǒng)計(jì)；PAK1及Spred1表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌組織PAK1、Spred1陽(yáng)性表達(dá)率比較 CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌、正常宮頸組織PAK1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為29.17%(7/24)、58.06%(18/31)、81.36%(48/59)、17.50%(7/40)，與正常宮頸、CINⅠ組織比較，CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌組織PAK1的陽(yáng)性表達(dá)率升高(P均<0.05)，與CINⅡ～Ⅲ組織比較，宮頸鱗癌組織PAK1的陽(yáng)性表達(dá)率升高(P<0.05)。 CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌、正常宮頸組織Spred1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.08%(17/24)、32.26%(10/31)、13.55%(8/59)、90.00%(36/40)，與正常宮頸組織比較，CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌組織Spred1的陽(yáng)性表達(dá)率降低(P均<0.05)，與CINⅠ組織比較，CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌組織Spred1的陽(yáng)性表達(dá)率降低(P均<0.05)，與CINⅡ～Ⅲ組織比較，宮頸鱗癌組織Spred1的陽(yáng)性表達(dá)率降低(P<0.05)。

2.2 PAK1、Spred1表達(dá)與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 PAK1蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌患者病理分級(jí)、有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。Spred1蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌患者病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 PAK1、Spred1表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 不同病變程度宮頸組織PAK1和Spred1表達(dá)相關(guān)性及其與高危型HPV感染的關(guān)系 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，不同病變程度宮頸組織PAK1與Spred1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.440，P=0.000)。

不同病變程度宮頸組織PAK1與與高危型HPV感染呈正相關(guān)(r=+0.206，-2.16；P<0.05)，不同病變程度宮頸組織Spred1表達(dá)與高危型HPV感染呈負(fù)相關(guān)(r=-2.16；P<0.05)。

3 討論

近些年隨著利妥昔單抗(Mabthera)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、 吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)等分子靶向藥物的臨床應(yīng)用，有部分腫瘤患者從中明顯受益，但仍有大部分患者并未取得較好的療效，因此，探索研究靶向治療敏感的分子信號(hào)通路網(wǎng)仍是腫瘤治療領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)及難點(diǎn)問(wèn)題。

P21 活化的激酶(p21-activated kinase，PAK)家族，是一類(lèi)進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在信號(hào)傳導(dǎo)通路中它是Rho家族下游的靶蛋白和MAPK上游的調(diào)節(jié)蛋白[5，8,9]，PAK家族成員根據(jù)其結(jié)構(gòu)的異同可分為兩大類(lèi)，PAKⅠ類(lèi)包括PAK1-3，主要通過(guò)結(jié)合CDC42 或Rac1被激活；PAKⅡ 類(lèi)包括PAK4-6，可與CDC42結(jié)合但卻不能使其被激活。PAK家族與食管癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)展與侵襲有關(guān)。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與多種因素相關(guān)PAK可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增值和病理性血管的形成和重構(gòu)，此研究證實(shí)了PAK家族在腫瘤病理性血管生成過(guò)程中的重要作用。PAK1是PAK家族最早發(fā)現(xiàn)且研究最多的成員，PAK1在細(xì)胞形成、運(yùn)動(dòng)和增殖等調(diào)節(jié)中起重要作用[10]。Chow等[11]報(bào)道 PAKl的表達(dá)與人鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)的分期和分級(jí)密切相關(guān)。在信號(hào)通路中PAK1是MAPK上游的調(diào)控因子，而根據(jù)現(xiàn)有研究已知，MAPK信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[12]。在宮頸癌中的發(fā)生發(fā)展中，MAPK途徑的激活與Notch1的失調(diào)協(xié)同作用導(dǎo)致人乳頭瘤病毒(HPV)驅(qū)動(dòng)的宮頸癌侵襲[13]，Notch1在生物進(jìn)化上高度保守，其活化形式NICD是多種信號(hào)通路的交匯點(diǎn)，Notch1在不同細(xì)胞中具有不同作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，其主要機(jī)制是抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增值[14]。Ong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PAKl抑制劑能夠抑制MAPK信號(hào)通路的活化，因此，PAK1與宮頸癌的發(fā)病存在潛在關(guān)系。PAK1在婦科腫瘤的研究較少，有學(xué)者[16]研究PAK1在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)，并且與HeLa細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。

Spred蛋白家族是酪氨酸激酶結(jié)合蛋白[6]，可作用于多條信號(hào)通路，能夠抑制多種刺激物誘導(dǎo)的Erk的激活，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育起負(fù)調(diào)控作用。Spred1定位于人基因的15q13.2上，可以特異性地抑制MAPK信號(hào)通路，但其作用位點(diǎn)目前尚不明確[17]。Spredl在RhoA介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，可抑制RhoA的活化，并且還可以與活化的RhoA結(jié)合，抑制其誘導(dǎo)的Rho激酶的激活。Miyoshi 等[18]研究指出：將Spred1基因和載體病毒整合并注入到試驗(yàn)大鼠體內(nèi)，腫瘤的生長(zhǎng)可被明顯抑制，由此可推斷，Spred1的高表達(dá)可減弱腫瘤組織的增殖能力。

本研究結(jié)果顯示，在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌組中，PAK1隨著宮頸病變程度的加重陽(yáng)性表達(dá)率升高，而PAK1蛋白的正常組與CINI組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示宮頸病變CINⅠ可向正常組織轉(zhuǎn)化；其余各組PAK1陽(yáng)性表達(dá)率間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Spred1陽(yáng)性表達(dá)率隨宮頸病變程度的加重降低，提示PAK1與Spred1的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，不同病變程度宮頸組織PAK1與Spred1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明在不同程度宮頸病變組織中可能出現(xiàn)了Spred1基因突變，使Spred1功能下調(diào)，從而對(duì)PAK家族的負(fù)調(diào)控作用減弱，引起PAK家族表達(dá)的上調(diào)，從而引起其下游蛋白MAPK作用的上調(diào)，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。目前研究表明信號(hào)通路Spred1/PAK1/MAPK信號(hào)通路與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。其原因可能為在Spred1/PAK1/MAPK信號(hào)通路中，Spred1為抑癌基因，PAK1為促癌基因，兩因子的調(diào)控呈負(fù)相關(guān)參與調(diào)節(jié)宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展；兩者在信號(hào)通路中均與MAPK相關(guān)聯(lián)，具體信號(hào)機(jī)制的作用靶點(diǎn)有仍待進(jìn)一步研究探討?；蛟S上調(diào)Spred1為靶向蛋白，或抑制PAK1的活化，從而抑制MAPK信號(hào)通路的活化。PAK1蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌的病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、臨床分期無(wú)關(guān)；Spred1蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌的病理分級(jí)有關(guān)，與年齡、病理分級(jí)、臨床分期無(wú)關(guān)；由于Ⅲ～Ⅳ級(jí)宮頸鱗癌樣本量?jī)H11例，可能存在結(jié)果的偏差，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量。

PAK1與Spred1高危型HPV感染的相關(guān)性分析可知不同病變程度宮頸組織PAK1與與高危型HPV感染呈正相關(guān)，不同病變程度宮頸組織Spred1表達(dá)與高危型HPV感染呈負(fù)相關(guān)。在宮頸鱗癌中，高危型HPV感染與PAK1共同促進(jìn)宮頸鱗癌的發(fā)病及進(jìn)展，因此治療高危型HPV感染可有效預(yù)防宮頸鱗癌發(fā)生。

綜上所述，與正常宮頸組織相比，宮頸上皮內(nèi)瘤變宮、頸鱗癌組織中PAK1表達(dá)升高、Spred1表達(dá)降低；隨宮頸病變程度加重，宮頸組織PAK1表達(dá)升高、Spred1表達(dá)降低。PAK1與Spred1呈負(fù)調(diào)控作用，在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。