血管緊張素（1?7）對(duì)胰島β 細(xì)胞自噬及磷酸化Akt 表達(dá)的影響

周夏利 陸春麗 孫明謹(jǐn)

1湖北醫(yī)藥學(xué)院第五臨床學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心（湖北隨州441300）；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院（湖北隨州441300）

胰島β細(xì)胞功能取決于β細(xì)胞的數(shù)量和分泌胰島素的能力。糖脂毒性（glucolipotoxicity，GLT）是指高血糖可協(xié)同增加游離脂肪酸（FFA）對(duì)細(xì)胞的毒性作用，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙及數(shù)量減少。GLT 可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激等引起β細(xì)胞自噬水平顯著升高以耐受凋亡。自噬（autophagy）是一個(gè)高度保守的分解代謝過(guò)程，能再循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)多余或受損成分，促進(jìn)應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞存活［1］。然而過(guò)多的自噬活化可導(dǎo)致β細(xì)胞死亡。血管緊張素（1?7）［angiotensin（1?7），Ang（1?7）］是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的生物活性成分，由血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）和其他酶分解血管緊張素I（AngⅠ）或血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成，與G 蛋白偶聯(lián)受體Mas 結(jié)合，在心臟、腎臟、腦和其他器官組織中發(fā)揮一系列與AngⅡ相反的作用［2］。研究表明Ang（1?7）干預(yù)可減輕β細(xì)胞功能障礙［3］，減少M(fèi)S?1 細(xì)胞脂性凋亡［4］，對(duì)調(diào)節(jié)胰島素分泌有顯著作用［5］。Ang（1?7）可抑制自發(fā)性高血壓大鼠腦組織自噬［6］，保護(hù)心肌細(xì)胞免受AngⅡ誘導(dǎo)的自噬［7］，但Ang（1?7）對(duì)胰島β細(xì)胞自噬的作用國(guó)內(nèi)外研究暫未見(jiàn)報(bào)道，因此探索Ang（1?7）對(duì)自噬的影響對(duì)保護(hù)胰島β細(xì)胞具有非常重要的意義。本研究旨在探討Ang（1?7）對(duì)GLT 孵育的胰島β細(xì)胞自噬和磷酸化Akt（p?Akt）表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 MIN6 細(xì)胞購(gòu)自江蘇無(wú)錫英紐瑞生物醫(yī)藥科技有限公司；DMEM（高糖、低糖）培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；鏈-青霉素溶液購(gòu)自Sigma 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；Ang（1?7）和A779 購(gòu)自上海吉爾生化公司；葡萄糖粉末、棕櫚酸（PA）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)游離脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司；CCK?8購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司；兔Beclin1 抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；鼠p62 抗體、兔/鼠GAPDH 抗體、AP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗、AP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；p?Akt 購(gòu)自CST 公司。

1.2 方法

1.2.1 棕櫚酸（palmitate acid，PA）的配制 稱取一定質(zhì)量的PA 溶于0.01 mol/L 的NaOH 溶液中使PA 的濃度為20 mmol/L，于70℃水浴鍋中振蕩溶解30 min。PBS 配制5% BSA 溶液，再按一定比例將保溫的PA 溶液與BSA 混合。實(shí)驗(yàn)中按比例將PA稀釋至終濃度為0.5 mmol/L。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MIN6 細(xì)胞用含15%胎牛血清及1%鏈-青霉素的高糖（4.5 g/L）DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞分為四組：（1）對(duì)照組（CON），（2）高糖高脂組（HGHF），（3）Ang（1?7）干預(yù)組，（4）A779 干預(yù)組。其中，CON 組細(xì)胞用含5 mmol/L 葡萄糖及BSA 的低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；HGHF 組細(xì)胞用含25 mmol/L 葡萄糖和0.5 mmol/L PA·BSA 的培養(yǎng)基培養(yǎng)；Ang（1?7）干預(yù)組細(xì)胞先給予Ang（1?7）10-6mol/L 預(yù)孵育30 min，再給予含25 mmol/L 葡萄糖和0.5 mmol/L PA·BSA 的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)；A779干預(yù)組細(xì)胞先給予A779 10-6M 預(yù)孵育30 min，再加入Ang（1?7）孵育30 min［5］，最后給予含25 mmol/L葡萄糖和0.5 mmol/L PA·BSA 的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。四組細(xì)胞均干預(yù)12 h。

1.2.3 Western?Blot 檢測(cè)MIN6 細(xì)胞p62、Beclin1及p?Akt 表達(dá) 用SDS?PAGE 凝膠電泳，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜，5%BSA 室溫封閉2 h，一抗（p?Akt、p62、GAPDH 均1∶1 000 稀釋，Beclin1 1∶400 稀釋）4 ℃搖床過(guò)夜孵育，二抗（AP 標(biāo)記山羊抗小鼠1∶1 000，AP 標(biāo)記山羊抗兔1∶800 稀釋）室溫孵育2 h，按照BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色，以GAPDH 為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 DAPI染色觀察MIN6細(xì)胞凋亡 按照DAPI染液說(shuō)明書(shū)，細(xì)胞以每孔1 × 106個(gè)接種于6 孔板中，按上述分組培養(yǎng)12 h 后，用PBS 清洗3 遍后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15～20 min，PBS 清洗3 遍，加一至兩滴DAPI 染液，避光反應(yīng)10 min，再用PBS清洗3 遍，吸干殘余液體，于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞有無(wú)凋亡。

1.2.5 CCK?8 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按照CCK?8 說(shuō)明書(shū)，細(xì)胞以每孔100 μL，每孔細(xì)胞數(shù)＞1 000 個(gè)接種于96 孔板，按不同分組將細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)12 h，每孔加入10 μL 的CCK?8 溶液，繼續(xù)孵育2 h，每隔一定時(shí)間置于酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm 處的吸光度（A450nm，OD值），然后按公式計(jì)算凋亡率［公式為：凋亡率=（對(duì)照組OD值-加藥處理組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3 次。采用SPSS 20.0 軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLT 及Ang（1?7）對(duì)自噬的影響 見(jiàn)圖1，與CON 組相比，HGHF 組p62 及Beclin1 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與HGHF 組相比，Ang（1?7）干預(yù)組p62 及Beclin1 的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）；與Ang（1?7）干預(yù)組相比，A779 干預(yù)組p62 及Be?clin1 的表達(dá)水平有所升高（P＜0.05）。

2.2 GLT 及Ang（1?7）孵育MIN6 細(xì)胞12 h DAPI染色觀察細(xì)胞凋亡 見(jiàn)圖2，CON 組可見(jiàn)細(xì)胞核藍(lán)染，熒光均勻呈類圓形或橢圓形，其余三組可見(jiàn)熒光顏色明亮，核染色質(zhì)固縮，向外周聚集，形成周邊化（箭頭所示，為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志）。與CON 組比較，HGHF 組細(xì)胞核數(shù)量明顯減少，可見(jiàn)大部分細(xì)胞核染色質(zhì)固縮。與HGHF 組比較，Ang（1?7）干預(yù)組核染色質(zhì)固縮明顯減少，且細(xì)胞數(shù)量明顯多于HGHF 組。與Ang（1?7）組比較，A779 干預(yù)組核染色質(zhì)固縮及周邊化增多。

圖1 GLT 及Ang（1?7）干預(yù)MIN6 細(xì)胞12 h p62 和Beclin1的表達(dá)Fig.1 Expressions of p62 and Beclin1 proteins exposure of MIN6 pancreatic beta cells to glucolipotoxicity in the presence or absence of angiotensin（1?7）for 12 hours

圖2 GLT 及Ang（1?7）干預(yù)MIN6 細(xì)胞12h DAPI 染色觀察細(xì)胞凋亡Fig.2 To observe apoptotic cells induced by glucolipotoxicity in the presence or absence of angiotensin（1?7）in MIN6 pancreatic beta cells for 12 hours by DAPI staining

2.3 GLT 及Ang（1?7）孵育12 h 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 如圖3所示，與CON組相比，HGHF組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），與HGHF 組相比，Ang（1?7）干預(yù)組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），與Ang（1?7）干預(yù)組相比，A779 干預(yù)組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）。

圖3 GLT 及Ang（1?7）干預(yù)MIN6 細(xì)胞12 h 的凋亡率Fig.3 Apoptosis rate of MIN6 pancreatic beta cells incubated with glucolipotoxicity alone or in combination with angiotensin（1?7）for 12 hours

2.4 GLT 及Ang（1?7）對(duì)p?Akt 表達(dá)的影響 如圖4所示，與CON 相比，HGHF 組p?Akt 水平顯著降低（P＜0.05）；與HGHF 組相比，Ang（1?7）干預(yù)組p?Akt 表達(dá)升高（P＜0.05）；與Ang（1?7）干預(yù)組相比，A779 干預(yù)組p?Akt 的表達(dá)水平下降（P＜0.05）。

圖4 GLT 及Ang（1?7）干預(yù)MIN6 細(xì)胞12 h p?Akt 的表達(dá)Fig.4 The level of phosphorylated Akt in MIN6 pancreatic beta cells incubated with glucolipotoxicity alone or in combination with angiotensin（1?7）for 12 hours

3 討論

胰島β 細(xì)胞數(shù)量減少和功能障礙是胰島素抵抗發(fā)展到顯性糖尿病的關(guān)鍵事件。細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激以及線粒體功能障礙等都與胰島β細(xì)胞功能障礙有關(guān)。其中，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致2 型糖尿病胰島β細(xì)胞功能障礙的主要機(jī)制。研究表明，GLT（PA 和葡萄糖）可誘導(dǎo)氧化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和泛素化蛋白積聚導(dǎo)致細(xì)胞凋亡性死亡［8］，Ang（1?7）可減少M(fèi)S?1 細(xì)胞內(nèi)PA 誘導(dǎo)的活性氧簇（ROS）產(chǎn)生［4］，也可減輕胰島β細(xì)胞凋亡［9］。與上述研究結(jié)果一致，本研究（圖2、圖3）通過(guò)體外培養(yǎng)MIN6 胰島β細(xì)胞，從細(xì)胞層面證實(shí)了GLT 可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，Ang（1?7）與Mas 受體結(jié)合發(fā)揮抗凋亡作用。

生理狀態(tài)下，自噬主要通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白和細(xì)胞器等機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免受外界應(yīng)激的損傷，抑制細(xì)胞凋亡［10］，對(duì)胰島β細(xì)胞的存活、功能和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要［11］。自噬與凋亡之間通過(guò)關(guān)鍵蛋白p62 和Beclin1 產(chǎn)生相互作用與聯(lián)系。p62 作為一種關(guān)鍵的自噬底物蛋白，主要功能是參與泛素化蛋白及衰老、受損細(xì)胞器的周轉(zhuǎn)循環(huán)，p62 積聚提示細(xì)胞受損［8］。Beclin1（BECN1）是一種自噬所必需的蛋白，與Ⅲ型PI3K 結(jié)合，在自噬體形成過(guò)程中起重要作用。PA/GLT 干預(yù)可增加p62 的表達(dá)［8］和自噬體的數(shù)量，通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及JNK 活化［12］而激活自噬。GLT 雖可刺激β細(xì)胞自噬但也可誘導(dǎo)溶酶體功能障礙而損傷自噬流［8］，本研究結(jié)果（圖1）與上述研究結(jié)果一致，考慮為GLT 可能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、激活JNK 上調(diào)自噬水平，但筆者未檢測(cè)自噬流、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和p?JNK 水平，下一步實(shí)驗(yàn)可通過(guò)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、p?JNK 的表達(dá)明確GLT 上調(diào)自噬的分子機(jī)制，同時(shí)進(jìn)一步檢測(cè)溶酶體功能證實(shí)GLT 通過(guò)損傷溶酶體功能誘導(dǎo)MIN6β細(xì)胞自噬流受損。

Ang（1?7）干預(yù)可調(diào)節(jié)胰島素敏感性和胰島素產(chǎn)生［9］，而胰島素是公認(rèn)的自噬抑制劑。已有研究表明，Ang（1?7）依賴Mas 受體可抑制高血壓所誘導(dǎo)的自噬，Ang（1?7）干預(yù)可能有利于阻止高血壓引起腦組織內(nèi)過(guò)度的自噬活化［6］；Mas 受體可介導(dǎo)Ang（1?7）抑制氧化應(yīng)激從而阻止AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬［7］。本研究結(jié)果首次表明Ang（1?7）與Mas 受體結(jié)合可抑制GLT 介導(dǎo)的自噬活化，說(shuō)明在胰島β細(xì)胞中Ang（1?7）以Mas 受體依賴方式發(fā)揮抗自噬作用，可能通過(guò)阻止GLT 誘導(dǎo)的過(guò)度的自噬活化減少β細(xì)胞損傷從而保護(hù)胰島β細(xì)胞。Ang（1?7）抑制自噬的機(jī)制還不清楚，考慮為：（1）誘導(dǎo)胰島素分泌抑制自噬。已有很多研究均證實(shí)Ang（1?7）/Mas 軸對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)外胰島的胰島素分泌有突出作用［5］。（2）拮抗AngⅡ的不利影響。GLT 可使胰島局部RAS 過(guò)度活化引起AngⅡ增加，AngⅡ可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、凋亡從而激活自噬［13］，Ang（1?7）與Mas 受體結(jié)合可拮抗AngⅡ?qū)σ葝uβ細(xì)胞的有害作用。

PI3K/Akt 信號(hào)通路廣泛存在于真核細(xì)胞中，Akt 在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和凋亡方面起關(guān)鍵作用?；罨腁kt 可通過(guò)磷酸化其絲氨酸或蘇氨酸位點(diǎn)激活或抑制其下游靶蛋白從而介導(dǎo)細(xì)胞凋 亡［14］；有研究證實(shí)PA 干預(yù)INS?1 細(xì)胞p?Akt 及p?mTOR 的表達(dá)水平隨時(shí)間增加而減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和Ⅲ型PI3K 參與PA 誘導(dǎo)的自噬激活，說(shuō)明Akt/mTOR 信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均與PA 誘導(dǎo)的自噬上調(diào)有關(guān)。另有研究給予PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制劑LY294002 處理MIN6 細(xì)胞后，PA 誘導(dǎo)的自噬水平進(jìn)一步增加，p?Akt 的表達(dá)降低，而?；切苋パ跄懰岷蚐P600125 均可抑制PA 誘導(dǎo)的p?Akt 減少，表明PA 通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和它下游的JNK 磷酸化可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK 活化介導(dǎo)PA 誘導(dǎo)的Akt 磷酸化減少參與PA 刺激β細(xì)胞自噬［12］。也有研究給予PA 干預(yù)可下調(diào)MS?1 細(xì)胞p?Akt 的表達(dá)，而Ang（1?7）可逆轉(zhuǎn)PA 的這一作用從而保護(hù)MS?1 細(xì)胞免受PA 誘導(dǎo)的凋亡［5］。研究表明Ang（1?7）發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡作用與誘導(dǎo)Akt 磷酸化有關(guān)［15］。與上述研究結(jié)果一致，本研究表明Ang（1?7）通過(guò)調(diào)控p?Akt 的表達(dá)可介導(dǎo)GLT 誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞自噬和凋亡。原因可能是：（1）PI3K/Akt 信號(hào)通路既參與細(xì)胞自噬也能參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。GLT 可能通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和它下游的JNK 活化抑制p?Akt 的表達(dá)，從而刺激β細(xì)胞自噬和凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK 活化介導(dǎo)GLT 誘導(dǎo)的p?Akt 減少參與GLT 誘導(dǎo)的自噬增加和凋亡；（2）Ang（1?7）可能通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素分泌和Akt 的磷酸化水平介導(dǎo)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。Ang（1?7）可增加胰島素分泌，使Akt 活化增加，從而阻止GLT 誘導(dǎo)過(guò)度的自噬活化及凋亡，減少β細(xì)胞損傷。下一步實(shí)驗(yàn)需給予PI3K/Akt 及p?JNK抑制劑證實(shí)Ang（1?7）抗自噬和抗凋亡的效應(yīng)由PI3K/Akt 及JNK 信號(hào)通路介導(dǎo)，重點(diǎn)闡述Ang（1?7）對(duì)自噬的具體機(jī)制。

綜上所述，本研究揭示了通過(guò)調(diào)控p?Akt 的表達(dá)，Ang（1?7）與Mas 受體結(jié)合可抑制GLT 誘導(dǎo)的β細(xì)胞自噬，證明了Ang（1?7）可以拮抗GLT 誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。因此，激活體內(nèi)外胰島局部Ang（1?7）/Mas 受體軸，以Ang（1?7）為干預(yù)靶點(diǎn)調(diào)控胰島功能，可能成為逆轉(zhuǎn)β 細(xì)胞損害的潛在治療策略。