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    來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖凋亡的影響及其作用機(jī)制

    2019-04-02 07:43:28劉玨張瀟迪張群鋒
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2019年5期
    關(guān)鍵詞:芳香化曲唑試劑

    劉玨 張瀟迪 張群鋒

    南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科(湖南衡陽421001)

    研究發(fā)現(xiàn),芳香化酶在子宮肌瘤組織中過度表達(dá),是合成雌激素的重要酶[1]。高度特異性的來曲唑是人工合成的第3 代非甾體類芳香化酶抑制劑,可抑制芳香化酶而降低激素水平,進(jìn)一步消除或減輕雌激素刺激腫瘤生長的作用[2-3]。目前,來曲唑已在子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等許多雌激素依賴性腫瘤治療中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[4]。本研究擬探討來曲唑作用雌二醇(E2)、B 細(xì)胞淋巴瘤-2 基因(bcl?2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase?3)的表達(dá)對子宮肌瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響,探討其可能的作用機(jī)制,為臨床治療子宮肌瘤提供新治療途徑與借鑒。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本采集與細(xì)胞培養(yǎng) 選取2015年3月至2016年1月在南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院手術(shù)切除的的8 例子宮肌瘤標(biāo)本(病理學(xué)證實(shí))。無菌條件下取肌瘤組織約1 cm3,放入4 ℃、無菌、含抗生素的PBS 緩沖液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)室。PBS 洗滌3 遍后剪碎至<1 mm3,離心管內(nèi)靜置,去上清后加入含800 U/mL I 型膠原酶的DMEM 培養(yǎng)基,于37 ℃消化成單個(gè)細(xì)胞后用PBS 液終止消化。過濾細(xì)胞懸液后經(jīng)1 500 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞。加入DMEM 懸浮并接種,置于含5% CO2的37 ℃恒溫箱里培養(yǎng)24 h 后,觀察細(xì)胞貼壁的生長情況。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底接近80%~90%時(shí)即可傳代。用臺盼藍(lán)染色,觀察細(xì)胞活性并記數(shù),在24 孔細(xì)胞培養(yǎng) 板接種5 × 105/mL 后在含5% CO2的37 ℃恒溫箱里繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞用α?actin 抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)法染色鑒定。后續(xù)實(shí)驗(yàn)取對數(shù)期細(xì)胞分為5 組,空白組加入相同量的DMSO 子宮肌瘤細(xì)胞,與4 組10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L不同濃度的來曲唑組。DMSO 溶解來曲唑且濃度低于1%。

    1.2 材料與試劑 胎牛血清(FBS,Hyclone 公司);RPMI?1640 細(xì)胞培養(yǎng)液(美國GIBCOBRL);MTT(華美生物);二甲基亞砜(DMSO,分析純,江蘇鴻聲);Western blot 試劑、免疫熒光試劑(上海碧云天);0.25%胰酶(吉泰科技);免疫組化試劑(SP9000 試劑盒、DAB 顯色劑)購自北京中杉金橋;臺盼藍(lán)等染色液及Triton X?100(10%)購自北京索萊寶;日本Takara 公司的RT?PCR 試劑(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I Mix PCR 試劑);RT?PCR 引物(上海生工);PVDF膜(0.45 μm,美國Millipore);來曲唑原藥(美國Sigma?Aldridi);兔抗人α?actin、bcl?2和caspase?3 抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(美國Santa Cruz)。

    1.3 儀器與設(shè)備 3111 型CO2培養(yǎng)箱、CL17R 型冷凍高速離心機(jī)均購自Thermo Forma 公司;低溫冰箱購自SANYO公司;上海中順SENCO R?201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;蘇州安泰的SW?CJ?1F 層流超凈生物學(xué)工作臺;美國Dynatech 公司的EPICS XL 型流式細(xì)胞儀;美國BioTek 公司的ELX808 酶聯(lián)免疫檢測儀;美國Bio?Rad 公司的蛋白印記檢測系統(tǒng)與凝膠成像儀;Step One PLUS 熒光定量PCR 儀;羅氏480 熒光定量PCR 儀,Leica Bond?Max 免疫組化儀,Bio?Rad S1000 梯度PCR 儀;日本Olympus 公司的XPS?18 型倒置熒光顯微鏡。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1.4.1 MTT 試驗(yàn) 用胰蛋白酶消化細(xì)胞后,將1×105/mL 接種于96 孔板中,封閉,鋪板,調(diào)零,加入來曲唑,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每日測定每組細(xì)胞的吸光值(A)值。實(shí)驗(yàn)終止前4 h,添加20 μL MTT試劑,繼續(xù)孵育>4 h。每孔添加200 μL DMSO,振蕩10 min,測定490 nm 處A值,繪制生長曲線。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-(A藥物組-A空白組)/(A細(xì)胞對照組-A空白組)×100%。

    1.4.2 細(xì)胞凋亡率檢測細(xì)胞增殖能力 來曲唑作用對數(shù)期細(xì)胞后,轉(zhuǎn)移懸液,1 500 r/min離心5 min,棄上清液用PBS 洗2 次,加入400 μg/mL 碘化丙啶,10 μg/mL Rnase,300 μL Triton?100,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。在室溫下避光染色20 min 后,流式細(xì)胞儀檢測,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

    1.4.3 測定E2含量 來曲唑作用72 h后,3 000 r/min離心20 min,棄上清液,-20 ℃凍存。采用放射免疫法測定E2 水平。

    1.4.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT?PCR) 采用Trizol 試劑提取各組總RNA,并制備cDNA。將β?actin為內(nèi)參照物,定量檢測bcl?2、caspase?3 mRNA表達(dá)水平。其中,β?actin 引物序列,上游5′?CCAT?CATCTTGCAGGAGCG?3′,下游5′?CTGGCAGTGA?GCTATACTCG?3′;bcl?2 引物序列,上游5′?TCTG?GTCCCTTCCAGCTAGT?3′,下游5′?CAGGGAGGCT?AAGGGGTA?3′;Caspase?3 引物序列,上游5′?CT?TTCTCAAGGACCACCG?3′,下游5′?TCACTTGGCA?TACAAATCA?3′;將cDNA、引物和SYBR Green 混合,分別在94 ℃、50 s,55 ℃、50 s,72 ℃、50 s,72 ℃、10 min,循環(huán)40 次,用焦碳酸二乙酯補(bǔ)齊20 μL 體系。每組均設(shè)復(fù)孔3 個(gè),每次重復(fù)3 次,對每個(gè)樣品CT 值按照2?ΔΔCT法統(tǒng)計(jì)分析mRNA 表達(dá)水平。

    1.4.5 Western blot 法檢測bcl?2、Caspase?3 蛋白表達(dá) 檢測各組總蛋白,利用8% SDS?PAGE 電泳50 μg總蛋白后,轉(zhuǎn)膜后,用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗,4 ℃孵育12 h。TBST 清洗3 次,10 min/次,加入1∶300 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,重復(fù)清洗,最后暗室曝光檢測蛋白條帶。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖的影響 與來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞增殖抑制率呈時(shí)間與濃度呈正相關(guān)(均r>0.7,均P<0.05)。見圖1。

    2.2 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞凋亡率的影響 來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率呈時(shí)間與濃度呈正相關(guān)(均r>0.8,均P<0.05)。見圖2。

    2.3 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞分泌E2 的影響 與來曲唑0 mol/L 組比較,隨著藥物濃度的增加,E2水平明顯降低(P<0.05),而來曲唑濃度呈越高E2水平越,呈濃度負(fù)相關(guān)性(均r<-0.6,均P<0.05)。見圖3。

    2.4 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞bcl?2、caspase?3 表達(dá)的影響 來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞72 h 后,bcl?2、bcl?2 mRNA 蛋白表達(dá)水平隨來曲唑濃度增加而降低(P<0.05),與濃度呈負(fù)相關(guān)(均r<-0.7,均P<0.05);而caspase?3、caspase?3 mRNA 蛋白表達(dá)水平隨來曲唑濃度增加而上升,與濃度呈正相關(guān)(均r>0.8,均P<0.05)。見圖4、5。

    圖1 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖的影響(n=8)Fig.1 Effect of letrozole on proliferation of uterine leiomyoma cells

    3 討論

    研究表明,來曲唑抑制雌激素合成后,既不會使雄激素在體內(nèi)大量積蓄,也不會影響孕激素水平,同時(shí)也不會降低腎上腺皮質(zhì)醇和醛固酮水平[3]。來曲唑不同于其他非甾體芳香化酶抑制劑,其結(jié)合亞鐵血紅蛋白中的鐵原子,能可逆地抑制芳香化酶與雄激素底物結(jié)合,阻斷雄激素催化為雌激素,不影響其他甾體激素生物合成[5]。人體的藥代動力學(xué)研究表明[6],口服來曲唑的生物利用度高達(dá)99.9%,可快速阻斷雌激素合成路徑,快速降低雌激素水平,縮小子宮及肌瘤體積;同時(shí)來曲唑半衰期長,且?guī)缀跛写x產(chǎn)物經(jīng)腎臟排泄,毒副作用非常小。目前,來曲唑治療子宮肌瘤的研究較少,鮮有系統(tǒng)的體外實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。

    圖2 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞凋亡率的影響(n=8)Fig.2 Effect of letrozole on apoptosis rate of uterine leiomyoma cells

    圖3 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞分泌E2 的影響(n=8)Fig.3 Effect of letrozole on E2 secretion in uterine leiomyoma cells

    圖4 Western blot 法檢測各組bcl?2、caspase?3 的表達(dá)Fig.4 The expression of bcl?2 and caspase?3 in each group by western blot

    WHYNOTT 等[7]研究顯示,促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH?α)具有保護(hù)宮頸癌患者的卵巢功能,縮小肌瘤體積。SCARPELLINI 等[8]研究認(rèn)為芳香化酶抑制劑在治療晚期和復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌方面的臨床益處有限,而RASDOSLAW 等[9]發(fā)現(xiàn)芳香化酶抑制藥與老年女性患者雌激素分泌密切相關(guān)。BOGLIOLO 等[10]認(rèn)為芳香化酶是合成雌激素的重要酶,影響著子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究組早前研究[11]發(fā)現(xiàn)利用來曲唑與GnRH?α 治療子宮肌瘤體積均明顯減小,但來曲唑治療患者的血清學(xué)改變,GnRH?α 治療患者的激素水平降低。ZHOU 等[12]研究發(fā)現(xiàn)來曲唑治療能顯著降低子宮肌瘤的大小和促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡。本研究顯示,來曲唑處理子宮肌瘤細(xì)胞后呈濃度與時(shí)間正相關(guān)。

    圖5 來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞72 h 后對子宮肌瘤細(xì)胞bcl?2、Caspase?3 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of letrozole on expression of bcl?2 and caspase?3 in uterine leiomyoma cells after 72 h treatment

    ZHENG 等[13]研究表明bcl?2 在正常子宮肌層中呈低表達(dá),在子宮肌瘤組織中呈高表達(dá)。本研究顯示來曲唑能抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞表現(xiàn)出與濃度呈正相關(guān),其機(jī)制可能與來曲唑下調(diào)bcl?2 表達(dá)和上調(diào)caspase?3 表達(dá)有關(guān)。此外,本研究亦發(fā)現(xiàn)來曲唑顯著性降低了子宮肌瘤細(xì)胞E2 水平。因此,推測高濃度來曲唑除了抑制芳香化酶的表達(dá),降低E2 合成,抑制肌瘤細(xì)胞增殖,還可能存在直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,其能否直接誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。

    綜上所述,來曲唑可能的通過下調(diào)bcl?2 和上調(diào)caspase?3 表達(dá)及降低E2 水平,來發(fā)揮抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。但來曲唑抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡的機(jī)制有待更多的作用途徑與信號通路的深入研究。

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