淫羊藿次苷Ⅱ通過改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和caspase-12信號(hào)改善SHR大鼠左心室功能

吳雨婷，李葉麗，付 舒，岳 云，孫瑞敏，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院，基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003)

心力衰竭是導(dǎo)致全球發(fā)病率和死亡率升高的主要原因，其中高血壓是最主要的危險(xiǎn)因素，大約75%的心衰患者伴有血壓升高[1]。心肌細(xì)胞凋亡是決定心臟結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵因素，在心力衰竭患者和動(dòng)物模型中都有心肌細(xì)胞凋亡[2]。心肌細(xì)胞凋亡除了使細(xì)胞數(shù)目減少，還可阻止氧化磷酸化過程，減少ATP生成，導(dǎo)致細(xì)胞能量障礙[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在心肌細(xì)胞凋亡中起重要作用[4]。受應(yīng)激刺激時(shí)，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子解離，使之激活，從而激活一系列凋亡信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。Caspase-12酶原的激活是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性分子之一[6]。

淫羊藿可用于治療心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和性功能障礙。淫羊藿次苷Ⅱ (icariside Ⅱ, ICS Ⅱ)是淫羊藿的活性成分之一，也是淫羊藿苷的活性代謝產(chǎn)物。淫羊藿苷能夠通過抑制ERS，減輕衣霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡[7]。我們之前的研究已經(jīng)表明，ICS Ⅱ能夠降低自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHRs)血壓、減少心肌細(xì)胞凋亡[8]。因此，本研究旨在證實(shí)ICS Ⅱ改善左心室功能的作用，并初步探討其機(jī)制是否與ERS及caspase-12信號(hào)有關(guān)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只14周齡的♂SHRs，6只魏凱二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào): SCXK(京)2012-0001。

1.2藥物與試劑ICS Ⅱ，購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司(批號(hào)：FY17460602，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)其純度≥ 98%，有效期24個(gè)月)，將ICS Ⅱ溶于適量雙蒸水中，并加入纖維素鈉制成混懸液，每次灌胃前先超聲混勻。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光混合物、GRP78和GAPDH引物(TaKaRa生物工程公司)；GRP78、cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3抗體(美國Abcam公司)；GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.3儀器Vevo2100小動(dòng)物超聲檢測(cè)儀(加拿大VisualSonics公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄儀(德國Eppendorf公司)；i-mark酶標(biāo)儀、real-time PCR擴(kuò)增儀、迷你 PROTEAN3電泳儀、迷你Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、CCD成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組WKY作為空白對(duì)照組，SHRs隨機(jī)分為模型組、ICS Ⅱ低、中、高劑量組和陽性藥組，每組6只。ICS Ⅱ組分別灌胃給予ICS Ⅱ 4 、8、16 mg·kg-1至26周齡，陽性藥組給予氯沙坦20 mg·kg-1，空白組和模型組給予等體積雙蒸水。

2.2大鼠左心功能檢測(cè)在第26周最后一次給藥結(jié)束后，大鼠麻醉后剃除左側(cè)胸部鼠毛，將其固定在檢測(cè)臺(tái)，并涂抹藕聯(lián)合劑。然后使用Vevo2100小動(dòng)物超聲設(shè)備獲取M型超聲心動(dòng)圖。測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室后壁舒張末期厚度、射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率。記錄連續(xù)10個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

2.3Real-timePCR法檢測(cè)左心室組織中GRP78mRNA水平提取大鼠左心室組織RNA，經(jīng)兩步法-聚合酶鏈反應(yīng)后，檢測(cè)GRP78、GAPDH mRNA的水平。反應(yīng)條件為：第1階段：95 ℃預(yù)變性10 min；第2階段：PCR反應(yīng)(95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，進(jìn)行40次循環(huán))；第3階段：熔解曲線分析(從55 ℃開始，每5 s下降0.5 ℃，進(jìn)行80次循環(huán))。引物序列見Tab 1。用相對(duì)定量法計(jì)算目的基因水平，以PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct值)為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，計(jì)算下列數(shù)據(jù)，Ct值的平均值=(Ct l+Ct 2)/2(重復(fù)管)；dCt=Ct值的平均值-中間值(相同檢測(cè)基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值)；基因的表達(dá)=2-dCt；相對(duì)定量=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)，將空白組mRNA表達(dá)設(shè)為1。

Tab 1 Primer pairs used in real time PCR

2.4Westernblot法檢測(cè)左心室組織中GRP78、cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)取大鼠左心室組織30 mg，剪碎后加入1 mL RIPA裂解液，冰上勻漿后，加入PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑各10 μL，靜置30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清液獲取蛋白樣本，BCA法測(cè)定樣本濃度。蛋白上樣量為10 μL(含30 μg蛋白)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%蛋白封閉液封閉2.5 h，一抗GAPDH(1 ∶10 000)、GRP78 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-12 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-9 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-3 (1 ∶2 000) 4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶2 000)常溫孵育1.5 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，CCD成像系統(tǒng)獲取圖像。將WKY組蛋白表達(dá)設(shè)為1。

3 結(jié)果

3.1ICSⅡ?qū)HRs左心功能的影響Fig 1超聲結(jié)果顯示，與WKY組相比，SHR組左心室舒張末期內(nèi)徑和左心室后壁舒張末期厚度增加(P<0.05)，而射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率降低(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ中、高劑量及陽性藥組左心室舒張末期內(nèi)徑和左心室后壁舒張末期厚度降低(P<0.05)，射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率增加(P<0.05)。

3.2ICSⅡ?qū)HRs左心室組織中GRP78mRNA和蛋白水平的影響與WKY組相比，SHR組GRP78 mRNA和蛋白水平明顯增加(P<0.05)，經(jīng)ICS Ⅱ和氯沙坦治療后，GRP78 mRNA和蛋白水平不同程度降低(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 1 Effect of ICS Ⅱ on left ventricular function in SHRs n=6)#P<0.05 vs WKY; *P<0.05 vs SHR

Fig 2 Effect of ICS Ⅱ on levels of GRP78 mRNA(A) and protein(B) in left ventricle tissues of SHRs n=6)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

3.3ICSⅡ?qū)HRs左心室組織中cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白水平的影響如Fig 3所示，與WKY組相比，SHR組cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；而給予ICS Ⅱ各劑量及氯沙坦治療后，cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白水平下調(diào)(P<0.05)。

Fig 3 Effect of ICS Ⅱ on levels of cleaved-caspase 12/9/3 protein in left ventricle tissues of SHRs n=3)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

4 討論

高血壓是全球常見疾病，是心腦血管事件的主要危險(xiǎn)因素[9]。改善左心功能和預(yù)防高血壓心臟病是治療高血壓的重要策略[10]。在本研究中，我們檢測(cè)了大鼠的左心室功能，模型組左心室舒張末期內(nèi)徑和后壁舒張末期厚度增加，而射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率降低，表明26周齡SHRs左心功能減退，而ICS Ⅱ能夠改善SHRs左心功能。在課題組之前的研究中，已經(jīng)確定ICS Ⅱ能夠降低SHRs血壓，并減少心肌細(xì)胞凋亡[8]，血壓降低是其心肌細(xì)胞凋亡減少的原因之一。在本研究中，課題組基于ERS-心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步研究ICS Ⅱ改善左心功能的作用機(jī)制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種廣泛存在于真核生物的膜性細(xì)胞器，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸和細(xì)胞內(nèi)鈣水平[11]。血壓升高引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化，阻斷蛋白質(zhì)加工，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白累積[12]。GRP78是促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊的重要分子伴侶，其水平間接反映了ERS水平[13]。本研究中，SHR組左心室GRP78蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，表明SHRs左心室心肌細(xì)胞發(fā)生了ERS。同時(shí)，在中、高劑量ICS Ⅱ組，上調(diào)的左心室GRP78蛋白表達(dá)被抑制，表明ICS Ⅱ可抑制SHRs心肌細(xì)胞的ERS。文獻(xiàn)報(bào)道，ERS可通過激活一系列凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。結(jié)合既往研究中，ICS Ⅱ能夠減少SHRs心肌細(xì)胞凋亡[8]，因此，我們推斷ICS Ⅱ改善SHRs左心室功能，與其抑制ERS、減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

caspase-12途徑是ERS-細(xì)胞凋亡的途徑之一。caspase-12屬于啟動(dòng)子半胱天冬酶，具有長(zhǎng)的N末端前結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，caspase-12酶原可在ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中被激活。caspase-12酶原與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF2) 結(jié)合形成復(fù)合物，當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，TRAF2從該復(fù)合物中解離，誘導(dǎo)caspase-12的激活[14]。此外，caspase-12酶原還可單獨(dú)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，胞質(zhì)中Ca2+升高導(dǎo)致鈣蛋白酶活化，并轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，激活caspase-12。而活化的caspase-12可以啟動(dòng)一個(gè)正反饋回路，通過caspase-9的活化來激活caspase-3[15]。caspase-3是執(zhí)行凋亡的半胱天冬酶，通過在天冬氨酸殘基處切割產(chǎn)生p12和p17亞基而激活，激活的caspase-3切割各種DNA修復(fù)酶和結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。本研究中，模型組cleaved-caspase-12/9/3蛋白水平增加，表明26周齡SHRs通過激活caspase-12信號(hào)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡；而ICS Ⅱ能夠下調(diào)caspase-12信號(hào)，減少心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善左心室功能。

綜上，ICS Ⅱ能夠改善SHRs左心室功能，其作用機(jī)制與改善ERS，下調(diào)caspase-12信號(hào)有關(guān)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室完成，感謝吳棟清、吳芹、黃波提供的幫助!)