菊苣根、莖的乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌及糞腸球菌抑菌差異性研究

韓 暢，黨 婷，王 茹，姚 佳，秦冬梅，張?jiān)粕?

(石河子大學(xué) 1. 藥學(xué)院新疆特種植物藥資源省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000)

菊苣(CichoriumintybusL.)為藥食同源的菊科菊苣屬植物，是我國(guó)維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材。維名“卡申納”(kasina)，其性味微苦、咸、涼，有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫之功效，用于治療濕熱黃疸、胃痛食少、水腫尿少等病癥[1]。菊苣含有倍半萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、糖類(lèi)等多種活性成分[2]，其根部含菊粉高達(dá)15%～20%，可做為食品添加成份[3]。另外，還含有山萵苣素、山萵苣苦素、綠原酸等成分，均具有抗菌消炎作用[4]。

有些藥用植物，多個(gè)部位可以同時(shí)入藥的，大多數(shù)存在藥效相似性，但入藥部位的療效卻不盡相同。菊苣的根、莖做為植物的不同器官，含有的活性成分亦有所不同，但均具有一定的抑菌作用[5-6]。目前，已報(bào)道的菊苣抑菌藥效研究?jī)H針對(duì)其中的單一部位，而對(duì)兩者之間抑菌效果差異性卻并不清楚，使藥用部位的選擇缺乏有效參考依據(jù)。本文從抑菌圈、最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)、生長(zhǎng)曲線(xiàn)等方面，對(duì)菊苣根、菊苣莖提取物的抑菌效果進(jìn)行比較分析，為明確菊苣更有效的抑菌部位提供參考。

1 材料

1.1藥物與試劑菊苣根、莖(批號(hào)：20151013、20151101)，均購(gòu)自新疆麥迪森維藥有限公司飲片廠；營(yíng)養(yǎng)瓊脂(批號(hào)：20170818)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth, NB，批號(hào)：20160112)，均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(批號(hào)：717J032)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)測(cè)試盒(批號(hào)：20180614)，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2儀器恒溫培養(yǎng)箱(Sheldon Manufacturing); SKY-100B 型恒溫?fù)u床(上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)；Vs-840-1 超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；3001 型全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀(美國(guó)Thermo Fisher)；5426XG 型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。

1.3菌種金黃色葡萄球菌、糞腸球菌，均由新疆醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

2 方法

2.1菊苣根、莖乙醇提取液的制備分別稱(chēng)取干燥的菊苣根、莖各100 g，粉碎后放入圓底燒瓶，加95%乙醇1000 mL，浸泡24 h后，在80 ℃水浴鍋中回流浸提，每次2 h，回流3次。收集3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮至10 g，得供試品浸膏(1 g相當(dāng)于10 g生藥量)備用。

2.2供試液的制備稱(chēng)取一定量的供試品浸膏，用DMSO溶解后，配制成不同濃度的供試液[7]。

2.3菌懸液的制備在超凈臺(tái)中，用接種環(huán)將凍存的供試菌種接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。再挑取單個(gè)菌落接種于NB培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，得所需菌懸液。

2.4抑菌活性研究

2.4.1牛津杯法測(cè)定抑菌圈直徑[8]將0.1 mL菌懸液加入到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上均勻涂布，再用無(wú)菌鑷子將滅菌的牛津杯(內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm的不銹鋼杯)放在含菌培養(yǎng)基上，往杯中加入0.1 mL供試藥液，使用DMSO作陰性對(duì)照，青霉素(6 g·L-1)作陽(yáng)性對(duì)照，放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。

2.4.2二倍稀釋法測(cè)定MIC[9]取無(wú)菌96孔板，每孔加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(含1% TTC)0.1 mL，在第1孔加入已知濃度的供試藥液0.1 mL，充分混勻后，吸取0.1 mL加入第2孔充分混勻，照此重復(fù)至第7孔，吸取0.1 mL棄去，再在1～7孔各加入0.02 mL的菌液。第8孔只加菌液，作細(xì)菌對(duì)照，第9孔只加供試藥液，作為供試藥液對(duì)照。然后將96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。

2.5菊苣根、莖95%乙醇提取物對(duì)供試菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)影響依據(jù)文獻(xiàn)[10]采用生長(zhǎng)曲線(xiàn)法觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。將金黃色葡萄球菌菌懸液分別轉(zhuǎn)接到含濃度為12.5、25、50 g·L-1的菊苣根、莖提取物的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中(糞腸球菌時(shí)藥物濃度為16、32、64 g·L-1)，調(diào)整初始菌量為106CFU·L-1，未處理的菌懸液作為空白對(duì)照，6 g·L-1青霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每2 h用酶標(biāo)儀測(cè)量樣品在600 nm 處的光密度值(OD值)，以繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2.6菊苣根、莖95%乙醇提取物對(duì)供試菌細(xì)胞壁的影響按照“2.4.3”的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行前處理，按照文獻(xiàn)[10]方法，37 ℃、180 r·min-1振蕩孵育，每隔1 h 取樣0.5 mL，4 500 r·min-1離心10 min，取上清，用AKP試劑盒測(cè)定上清液中AKP濃度。

2.7菊苣根不同溶劑萃取物的制備干燥的菊苣根500 g粉碎，95%乙醇50 ℃ 浸泡5次，每次3 d，真空濃縮得到浸膏(1 g相當(dāng)于10 g生藥量)，再將浸膏用25 ℃蒸餾水混勻，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇與水1 ∶1萃取，常溫?fù)]發(fā)溶劑后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水層萃取物[11]。

3 結(jié)果

3.1菊苣根、莖對(duì)抑菌圈直徑的影響菊苣根、莖提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Inhibition zone diameter of chicory roots and

“-” is no inhibition zone. Extract concentration is 500 g·L-1, penicillin concentration is 6 g·L-1.

3.2菊苣根、莖的最小抑菌濃度菊苣莖95%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌的MIC值分別為50 g·L-1、64 g·L-1；菊苣根95%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌的MIC值均為64 g·L-1。

3.3菊苣根、莖對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響與空白對(duì)照組相比，菊苣莖提取物濃度為25、50 g·L-1時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌增殖具有明顯的抑制作用(P<0.01，F(xiàn)ig 1A)；菊苣根提取物濃度為50 g·L-1時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌增殖也具有明顯的抑制作用(P<0.05，F(xiàn)ig 1B)。菊苣莖提取物濃度為64 g·L-1時(shí)，對(duì)糞腸球菌增殖具有明顯抑制作用(P<0.01)，濃度為32 g·L-1時(shí)，對(duì)糞腸球菌增殖也有明顯的抑制作用(P<0.05)，見(jiàn)Fig 1C)；菊苣根提取物濃度為64、32 g·L-1時(shí)，對(duì)糞腸球菌皆具有明顯抑制增殖作用(P<0.01，F(xiàn)ig 1D)。為了更直觀地對(duì)比根、莖對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的抑制效果，本研究比較了提取物處理10 h后的菌液OD值，F(xiàn)ig 2結(jié)果表明，菊苣莖提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果較好，而菊苣根提取物則對(duì)糞腸球菌抑制作用較好。

3.4菊苣根、莖對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌AKP酶的影響菊苣根、莖提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的胞外AKP濃度均有明顯的影響。如Fig 3所示，在50 g·L-1的菊苣根、莖提取物處理下，金黃色葡萄球菌、糞腸球菌胞外溶液AKP含量明顯增加(P<

A: Staphylococcus aureus; B: Staphylococcus aureus; C: Enterococcus faecalis; D: Enterococcus faecalis.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

Fig 2 Optical density value of bacterial suspension n=3)

A: Staphylococcus aureus; B: Enterococcus faecalis.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

0.05)。結(jié)果表明，菊苣根、莖提取物對(duì)兩種菌的細(xì)胞壁均有破壞作用，造成金黃色葡萄球菌和糞腸球菌細(xì)胞壁通透性增加，細(xì)胞內(nèi)AKP滲出。

3.5菊苣根不同溶劑萃取物抑菌活性分析Tab 2結(jié)果顯示，與菊苣根95%乙醇提取物相比，正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物在濃度為200 g·L-1時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用均明顯增強(qiáng)(P<0.01)；乙酸乙酯部位對(duì)糞腸球菌抑制作用也明顯增強(qiáng)(P<0.01)，正丁醇萃取物抑菌效果與95%乙醇提取物抑菌效果沒(méi)有差異；石油醚萃取物對(duì)上述兩種菌均沒(méi)有抑制作用。

Fig 3 Changes of concentration of AKP in bacterial suspension n=3)

A: Staphylococcus aureus; B: Staphylococcus aureus; C: Enterococcus faecalis; D: Enterococcus faecalis.*P<0.05vsnegative control.

Tab 2 Inhibition zone diameter of different solvent extracts of

“-” is no inhibition zone. Test sample concentration is 200 g·L-1, penicillin concentration is 6 g·L-1.**P<0.01vs95% ethanol extract of chicory roots.

4 討論

據(jù)報(bào)道，菊苣根比菊苣莖部位含有更多的山萵苣素和山萵苣苦素，而菊苣莖中則含有較多的秦皮乙素和綠原酸[3]，另外，菊苣莖中總黃酮含量超過(guò)菊苣根中的含量[12-13]，藥物活性成分的差異，導(dǎo)致兩者藥效的天然差別。本實(shí)驗(yàn)從繪制的生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以看出，金黃色葡萄球菌對(duì)菊苣莖的處理較為敏感，糞腸球菌對(duì)菊苣根的處理更為敏感。當(dāng)細(xì)菌受到藥物處理后，細(xì)胞外部完整性被破壞，會(huì)造成菌體內(nèi)AKP滲出[10]。細(xì)胞外溶液AKP濃度的變化表明，菊苣根、菊苣莖提取物會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，造成細(xì)菌內(nèi)容物滲出，導(dǎo)致了細(xì)菌的死亡。

為了進(jìn)一步明確菊苣根的有效抑菌成分，本研究用不同溶劑對(duì)菊苣根95%乙醇提取物再進(jìn)行萃取，分析不同極性萃取物的抑菌活性，結(jié)果顯示，菊苣根乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最為明顯。乙酸乙酯屬于中等極性萃取溶劑，推測(cè)其萃取物中可能含有游離生物堿、萜類(lèi)、有機(jī)酸、黃酮、香豆素苷元等，而萜類(lèi)化合物正是具有殺菌、消炎、抗腫瘤的生物活性物質(zhì)[14]。山萵苣苦素是菊苣根中的主要成分之一，為萜類(lèi)化合物，因此，推測(cè)菊苣根、菊苣莖含有的主要有效抑菌成分可能為山萵苣苦素。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)中菊苣提取實(shí)驗(yàn)在石河子大學(xué)新疆特種植物藥資源省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，抑菌實(shí)驗(yàn)在新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所完成。感謝各位老師和同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)的幫助！)