99mTc-轉(zhuǎn)鐵蛋白-DTPA-Gd核素/磁性雙模態(tài)分子影像探針基于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)水平的腫瘤成像

顧丙新，孫玉云，楊忠毅，羅建民，張建平，章英劍

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，上海 200032；3.上海分子影像探針工程技術(shù)研究中心，上海 200032

轉(zhuǎn)鐵蛋白（Holo-Transferrin，Tf）受體（transferrin receptor，TfR）是一種廣泛存在于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，在介導(dǎo)鐵以及微量元素的運(yùn)輸與轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)［3］，多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)TfR，并已被開發(fā)為抗腫瘤藥物遞送的靶點(diǎn)。然而，靶向治療的效果在很大程度上依賴于腫瘤細(xì)胞的TfR表達(dá)情況。目前，臨床及科研檢測TfR最常用的方法為免疫組織化學(xué)分析，但該種檢測方法為離體測定、有創(chuàng)傷性，且在多病灶的情況下作用較為局限。分子影像［4］能夠反映活體狀態(tài)下生物進(jìn)程中分子水平的變化，為在體、無創(chuàng)性檢測TfR提供了契機(jī)。本課題組前期合成了99mTc-Tf-DTPA-Gd核素/磁性雙模態(tài)分子影像探針，并探討了在鼠源性三陰性乳腺癌診斷中的應(yīng)用［5］，現(xiàn)討論該探針用于檢測多種人源性腫瘤TfR表達(dá)情況的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要材料與儀器

Tf購自美國Sigma-Aldrich公司，氯化釓（GdCl3）及氯化亞錫購自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，Na99mTcO4購自上海欣科醫(yī)藥有限公司，抗人TfR抗體購自美國Abcam公司，小動(dòng)物磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）儀器（型號(hào)BioSpec 7.0T/20）購自德國Bruker公司，小動(dòng)物單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)（singlephoton emission computed tomography，SPECT）/計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)（computed tomography，CT）儀器（型號(hào)Nano SPECT/CT PLUS）購自美國Bioscan公司。

1.2 99mTc-Tf-DTPA-Gd的制備與表征

雙模態(tài)探針99mTc-Tf-DTPA-Gd的制備過程及表征參照本課題組前期研究［5］。以下為探針合成技術(shù)路線的簡述：在5 mL離心管中，將54 mg DTPAa粉末緩慢加入30 mg 轉(zhuǎn)鐵蛋白（15 mg/mL，溶于0.1 mol/L碳酸氫鹽緩沖液，pH=9.0），室溫下持續(xù)攪拌10 h后超濾離心（截留相對(duì)分子質(zhì)量為10×103，8 000 rpm，15 min）提純Tf-DTPA；將4 mg GdCl3加入Tf-DTPA（15 mg/mL，溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液，p H 為6.5），室溫下持續(xù)攪拌10 h后超濾離心提純Tf-DTPA-Gd。在1.5 mL離心管中，加入0.5 mg Tf-DTPA-Gd（1 mg/mL，溶于水），74 MBq Na99mTcO4和2 μL SnCl2溶液（1 mg/mL，溶于0.1 mol/L HCl）室溫下震蕩反應(yīng)30 min。

1.3 裸小鼠移植瘤模型的建立

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。ACHN（人腎癌細(xì)胞）、GBC-SD（人膽囊癌細(xì)胞）、HCT-8（人腸癌細(xì)胞）、MDAMB-468（人乳腺癌細(xì)胞）、SGC-7901（人胃癌細(xì)胞）、SMMC-7721（人肝癌細(xì)胞）、SW1990（人胰腺癌細(xì)胞）、Tca-8113（人舌癌細(xì)胞）和U87（人膠質(zhì)瘤細(xì)胞）經(jīng)傳代培養(yǎng)后，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞100 μL（約1×106個(gè)細(xì)胞），分別接種于每只BALB/c雌性裸小鼠右后肢；PC-3（人雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞）接種于每只BALB/c雄性裸小鼠右后肢；3～6周后待腫瘤長至0.8～1.0 cm時(shí)進(jìn)行顯像。

1.4 小動(dòng)物SPECT/CT顯像及小動(dòng)物MRI顯像

1.4.1 小動(dòng)物SPECT/CT顯像

取各模型荷瘤小鼠各3只，經(jīng)尾靜脈注射200 μL含600 μCi（22.2 MBq）99mTc-Tf-DTPAGd，4 h后用2.5%異氟烷麻醉，行SPECT/CT顯像。通過Bioscan自帶InVivoScope軟件重建圖像，并計(jì)算腫瘤與肌肉組織的靶本比即靶區(qū)/肌肉組織（target-to-muscle ratios，T/M）。

1.4.2 小動(dòng)物MRI顯像

取MDA-MB-468和PC-3荷瘤小鼠各3只，經(jīng)尾靜脈注射0.05 mmol Gd/kg Tf-DTPA-Gd，于注射前和注射后4 h，用2.5%異氟烷麻醉后行MRI顯像。線圈及掃描參數(shù)：選用40 mm內(nèi)徑小鼠全身容積線圈；采用T1-MSME序列對(duì)荷瘤鼠進(jìn)行冠狀位采集，掃描參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)時(shí)間（time of repetition，TR）=400 ms，回波時(shí)間（time of echo，TE）=8.0 ms，層厚=1.0 mm，視野（field of vision，F(xiàn)OV）=35 mm×25 mm，矩陣（Matrix）=256×256。通過Bruker自帶ParaVison 6.0工作站重建并分析圖像數(shù)據(jù)，在腫瘤部位勾畫感興趣區(qū)（region of interest，ROI），測量腫瘤部位的T1信號(hào)強(qiáng)度（signal intensity，SI）值，并通過公式計(jì)算注射后腫瘤部位相對(duì)信號(hào)增強(qiáng)（relative signal enhancement，rSE）：rSE（%）=SIpost/SI0×100%

其中，SIpost為注射探針之后腫瘤部位的信號(hào)強(qiáng)度值，SI0為注射探針前腫瘤部位的信號(hào)強(qiáng)度值。

1.5 H-E染色與免疫組織化學(xué)分析

顯像結(jié)束后，拉頸處死荷瘤鼠摘取腫瘤組織，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片，行H-E染色和TfR免疫組織化學(xué)檢測。采用H-score法［6］進(jìn)行半定量：根據(jù)染色陽性細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度，陽性細(xì)胞比例＜33%為（-）；33%≤陽性細(xì)胞比例＜66%或陽性細(xì)胞比例為100%但染色強(qiáng)度低等為（+）；66%≤陽性細(xì)胞比例或陽性細(xì)胞比例為100%但染色強(qiáng)度中等為（++）；陽性細(xì)胞比例為100%且染色強(qiáng)度高等為（+++）。每個(gè)切片由兩位高年資病理科醫(yī)師獨(dú)立打分，且每個(gè)樣品重復(fù)3次取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x±s表示。采用兩樣本t檢驗(yàn)及Spearman分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 99mTc-Tf-DTPA-Gd 的表征

99mTc-Tf-DTPA-Gd每分子轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)26個(gè)釓原子（Gd），標(biāo)記率及放化純均大于96%，并在50%的胎牛血清中有較好的穩(wěn)定性，8 h的標(biāo)記率仍大于90%，可用于體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)。

2.2 小動(dòng)物SPECT/CT顯像

經(jīng)尾靜脈注射探針99mTc-Tf-DTPA-Gd后4 h，ACHN、GBC-SD、HCT-8、MDA-MB-468、SGC-7901、SMMC-7721、SW1990、Tca-8113和U87腫瘤可清晰顯影（圖1A），其中MDAMB-468、SMMC-7721和U87腫瘤具有較高的T/M值（圖1B），ACHN、GBC-SD、HCT-8、SGC-7901、SW1990和Tca-8113腫瘤T/M值相對(duì)較低；而PC-3腫瘤幾乎無放射性攝取，接近肌肉本底，T/M值與MDA-MB-468相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.919，P=0.002）。顯像示肝臟、腸道有很高的放射性攝取，表明探針主要經(jīng)消化系統(tǒng)排泄；同時(shí)腎和膀胱也有較高的放射性攝取，提示少部分探針經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄。

2.3 小動(dòng)物MRI顯像

注射探針前，MDA-MB-468與PC-3移植瘤組織的信號(hào)強(qiáng)度與周圍肌肉組織一致。經(jīng)尾靜脈注射探針Tf-DTPA-Gd后4 h，MDA-MB-468腫瘤輪廓清晰顯示，腫瘤組織強(qiáng)化明顯，與周圍幾乎無強(qiáng)化的肌肉組織形成“亮”的陽性對(duì)比（圖2A）；但PC-3移植瘤信號(hào)強(qiáng)度仍與周圍肌肉組織一致，并無肉眼可辨別的明顯強(qiáng)化，其供血血管可清晰顯示（圖2A）。MDA-MB-468移植瘤組織較注射探針前T1信號(hào)相對(duì)增強(qiáng)達(dá)（154.88±8.71）%，而PC-3腫瘤為（111.31±3.46）%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.441，P=0.001，圖2B）。

圖1 10種移植瘤模型的SPECT/CT顯像及T/M值Fig.1 Small-animal SPECT/CT imaging and the value of T/M in 10 kinds of xenograft tumor models

圖2 MDA-MB-468與PC-3移植瘤模型的MRI顯像、信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)比以及免疫組織化學(xué)染色Fig.2 MRI quantitative analysis and immunohistochemical staining in MDA-MB-468 and PC-3 tumor models

2.4 免疫組織化學(xué)染色與H-E染色

免疫組織化學(xué)染色可清晰定位TfR的位置（圖2A）。10種移植瘤模型中，除PC-3表達(dá)陰性，其余10種均不同程度表達(dá)TfR（圖3），并且在MDA-MB-468、SGC-7901、SMMC-7721和U87移植瘤表達(dá)較高。進(jìn)一步分析我們發(fā)現(xiàn)，TfR的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果與探針的T/M值呈明顯的正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為r=0.915，P＜0.001）。探針在細(xì)胞及體內(nèi)的毒性實(shí)驗(yàn)已在前期研究中完成，此處，我們再次評(píng)估探針對(duì)10種移植瘤組織是否會(huì)有刺激或損傷作用。H-E染色結(jié)果顯示，注射探針后腫瘤組織并無變性、水腫、炎性浸潤及壞死等表現(xiàn)，表明探針對(duì)腫瘤組織沒有明顯影響（圖4）。

圖3 10種移植瘤組織表達(dá)TfR的半定量分析Fig.3 The semi-quantitative analysis of TfR in different xenograft tumor models

圖4 10種移植瘤組織的H-E染色Fig.4 H-E staining of 10 xenograft tumors

3 討 論

目前，基于TfR的在體成像研究涉及到熒光［7］、MRI［8］及核素［9］等。然而，任何單一模態(tài)成像都有一定的局限性［10］，如核素的高靈敏度、低分辨率，MRI的高分辨率、低靈敏度。有鑒于此，將兩種或多種成像技術(shù)優(yōu)勢融合的多模態(tài)成像應(yīng)運(yùn)而生［11］。99mTc的半衰期適中（6 h）、能量單一（141 keV γ射線）、標(biāo)記條件溫和，是臨床理想的核素；Gd能夠縮短組織弛豫時(shí)間，提供陽性對(duì)比，是目前臨床最常用的MRI對(duì)比劑。因此，本研究探討99mTc標(biāo)記、Gd螯合的轉(zhuǎn)鐵蛋白用于檢測10種移植瘤表達(dá)TfR情況的可能性。

有研究［12］報(bào)道，TfR的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)。然而，不同腫瘤的惡性程度沒有明確界定，且不同研究中同一腫瘤表達(dá)TfR也有出入［13-14］。本研究中，10種不同組織來源的移植瘤模型中，有9種移植瘤不同程度地?cái)z取99mTc-Tf-DTPA-Gd，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，9種移植瘤均表達(dá)TfR；而PC-3移植瘤不攝取探針，且免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果也顯示該腫瘤幾乎不表達(dá)TfR，與成像結(jié)果一致；同時(shí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，免疫組織化學(xué)檢測與探針的T/M值呈明顯的正相關(guān)，表明99mTc-Tf-DTPA-Gd成像能夠反映腫瘤TfR表達(dá)的情況。在前期研究中［5］，Tf-DTPA-Gd能夠特異性結(jié)合TfR，且腫瘤部位強(qiáng)化時(shí)間達(dá)24 h以上。本研究中，MRI結(jié)果也提示高表達(dá)TfR的MDA-MB-468移植瘤攝取Tf-DTPA-Gd較不表達(dá)TfR的PC-3模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明Tf-DTPA-Gd MRI也能夠反映腫瘤TfR表達(dá)情況。在SPECT成像中，我們可以精確地定位腫瘤的位置，但腫瘤結(jié)構(gòu)、與周邊組織的聯(lián)系、供血血管等信息無法判斷。MRI則可以清晰地顯示腫瘤結(jié)構(gòu)分層、有無壞死、對(duì)周邊正常組織的侵襲情況，同時(shí)還能明確地分辨出腫瘤的供血血管。因此，核素、磁性雙模態(tài)成像的融合對(duì)提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性、治療方案的選擇、療效評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測以及轉(zhuǎn)移灶的尋找都具有重要的臨床意義。

轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠穿透血腦屏障，對(duì)顱內(nèi)惡性腫瘤的診斷有一定的優(yōu)勢［14-15］。本研究中，U87腫瘤高表達(dá)TfR，對(duì)探針99mTc-Tf-DTPA-Gd也有較高的攝取。同時(shí)，MRI具有超高的軟組織分辨率，且能多平面、多功能序列成像，是目前診斷腦腫瘤的首選成像方式。因此，99mTc-Tf-DTPAGd是一種理想的檢測腦腫瘤的雙模態(tài)探針。

由于核素成像時(shí)注射探針的物質(zhì)的量在納摩爾（nmol）水平即可［16］，而MRI檢查時(shí)需達(dá)到毫摩爾（mmol）水平，因此本課題組在SPECT成像實(shí)驗(yàn)中使用的是核素、磁性雙模態(tài)探針99mTc-Tf-DTPA-Gd，而MRI檢測中則使用的是磁性單模態(tài)探針Tf-DTPA-Gd。為達(dá)到一次注射即可得到兩種模態(tài)對(duì)比，本課題組將進(jìn)一步優(yōu)化探針，如提高釓的偶聯(lián)率或螯合其他弛豫率較高的元素。