不同產(chǎn)地香薷HPLC指紋圖譜的建立及7種成分測定

張依欣， 凡若楠， 張崇佩， 龔千鋒， 鐘凌云， 于 歡

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330004）

香薷，又名香葇、香茹，為江西省道地藥材，其入藥始見于 《名醫(yī)別錄》，古人治暑病，常以香薷飲為首藥，是唇形科植物石香薷Mosla chinensis Maxim或江香薷Mosla chinensis‘Jiangxiangru’的干燥地上部分［1］。主要功效為發(fā)汗而解表，化濕和中而解暑，開宣肺氣而利水消腫［2］。香薷作為全草入藥，臨床上主要用于治療暑濕感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛無汗、水腫、腹痛吐瀉。香薷中的活性成分主 要為 揮發(fā) 油 類［3-5］、 黃 酮 類［6-9］、 多 糖 類等［10-11］，現(xiàn)代研究表明香薷中黃酮類是其發(fā)揮抗菌抗炎癥作用的主要成分之一［12-13］?，F(xiàn)對不同產(chǎn)地不同批次的香薷飲片及鮮品建立HPLC指紋圖譜，并測定7種黃酮類成分的含有量，以期對香薷質(zhì)量控制及道地藥材考證提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Ultimate 3000型高效液相色譜儀 （美國Dionex公司，配置PDA-3000型二極管陣列紫外檢測器和Chromeleon工作站）；AE240電子分析天平 （十萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 （鞏義市英峪予華儀器廠）；中藥粉碎機(jī)（長沙旭朗粉碎機(jī)械有限公司）；3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)篩 （紹興市上虞張興紗篩廠）；KQ-5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；水相和有機(jī)相過濾膜 （上海市新亞凈化器件廠）。

1.2 藥材與試劑 分析純磷酸 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；色譜純乙腈、甲醇、分析純乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）；水為娃哈哈純凈水。咖啡酸 （批號(hào)BCTG-0286，江西本草天工生物技術(shù)有限公司）；蘆丁 （批號(hào)100080-200707，中國食品藥品檢定研究院）；芹菜苷 （批號(hào)BCTG-0208，江西本草天工生物技術(shù)有限公司）；木犀草苷 （批號(hào)BCTG-0278，江西本草天工生物技術(shù)有限公司）；木犀草素 （批號(hào)BCTG-0209，江西本草天工生物技術(shù)有限公司）；芹菜素 （批號(hào)BCTG-0257，江西本草天工生物技術(shù)有限公司）；黃芩素-7-甲醚 （批號(hào)20560-201610，南昌貝塔生物科技有限公司）。

香薷藥材于2017年間在醫(yī)藥公司與藥材市場收購的飲片及江西新余市分宜縣采收的江香薷鮮品12個(gè)不同批次，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)張壽文教授鑒定為正品，見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取咖啡酸395.00 μg、 蘆丁 530.00 μg、 芹菜苷 784.00 μg、木犀草苷 535.00 μg、 木犀草素 541.00 μg、 芹菜素 406.00 μg、 黃 芩 素-7-甲 醚 400.00 μg 置 于25 mL量瓶中，加甲醇定容，分別配制成質(zhì)量濃度為 158.00、 212.00、 313.60、 216.40、 214.00、162.40、 160.00 μg／mL 的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 鮮品前處理 將新鮮采摘的香薷藥材搶水洗凈，后放置陰涼通風(fēng)處陰干，剪成1～2 cm短段，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取香薷藥材2.000 g，加入20 mL 95%乙醇浸泡1 h后超聲（200 W，40 kHZ）45 min，過濾，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.3 色譜條件 Diamosil C18色譜柱 （250 nm×4.6 nm，5 μm）； 乙腈流動(dòng)相 （A） -0.2% 磷酸（B），梯度洗脫，程序見表2；檢測波長210 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。在此色譜條件下，7種成分得到很好的分離，保留時(shí)間與對照品一致。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取 “2.1”項(xiàng)下對照品溶液，在 “2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 黃芩素-7-甲醚對照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC reference spectrum of 5，6-dihydroxy-7-methoxyflavone

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量至5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配制不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，在 “2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3。素-7-甲醚各主要共有峰相對保留時(shí)間和峰面積RSD＜2.82%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品 （S1）溶液，在 “2.3” 項(xiàng)色譜條件下， 分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測得咖啡酸、蘆丁、芹菜苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、黃芩素-7-甲醚各主要共有峰相對保留時(shí)間和峰面積RSD＜2.82%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含有量的S1香薷供試品1.000 g，分別加入高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的7種對照品，加入20 mL 95%乙醇，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度減半的供試品溶液，在 “2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，見表4。

2.4.7 樣品含有量測定 取香薷樣品，按 “2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在 “2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測定含有量，結(jié)果見表5。

可知，天齊堂飲片公司的香薷藥材 （S1）均含有此7種成分，且芹菜苷與黃芩素-7-甲醚在所有批次中均能檢測到，由于黃芩素-7-甲醚的含有量相對最高，便于指認(rèn)，因此指紋圖譜主要以S1中黃芩素-7-甲醚為參照峰。

2.5 指紋圖譜建立及分析

2.5.1 指紋圖譜建立 稱取藥材粉末約2.000 g，

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液 （S1）適量，0.22 μm微孔濾膜過濾，在 “2.3”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得咖啡酸、蘆丁、芹菜苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、黃芩素-7-甲醚各主要共有峰相對保留時(shí)間和峰面積RSD＜2.75%，表明該方法精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 平行稱取6份同一樣品（S1），按 “2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在 “2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得咖啡酸、蘆丁、芹菜苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、黃芩

按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄60 min色譜圖，見圖2。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

表5 各成分含有量測定結(jié)果 （mg）Tab.5 Results of content determination of various constituents （mg）

圖2 香薷HPLC對照圖譜Fig.1 HPLC reference spectrum of M．chinensis

2.5.2 共有指紋峰標(biāo)定 將12批次樣品HPLC指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A版），以S1號(hào)批次香薷藥材為參照圖譜，以平均數(shù)法、時(shí)間窗寬度0.1生成對照圖譜。詳細(xì)比較了所有批次樣品的HPLC色譜圖，共確定了14個(gè)特征共有峰，其中2號(hào)峰為咖啡酸、4號(hào)峰為蘆丁、5號(hào)峰為芹菜苷、6號(hào)峰為木犀草苷、7號(hào)峰為木犀草素、9號(hào)峰為芹菜素、10號(hào)峰為黃芩素-7-甲醚。以10號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各色譜峰保留時(shí)間和保留峰面積與同一圖譜中10號(hào)峰的保留時(shí)間和保留峰面積比值，共有峰相對保留時(shí)間的RSD值較小，而相對峰面積的RSD值較大，表明不同產(chǎn)地香薷的指紋圖譜中主要峰出峰時(shí)間接近，整體圖貌基本一致，但各個(gè)產(chǎn)地以及飲片、鮮品中含有量差別較大。

2.5.3 參照峰選擇 通過觀察色譜圖，發(fā)現(xiàn)10號(hào)峰峰面積較大，出峰時(shí)間適宜，其分離度較好且含有量較穩(wěn)定 （8號(hào)、13號(hào)、14號(hào)峰的出峰時(shí)間也適宜，但是個(gè)別峰不及10號(hào)峰穩(wěn)定性高，且10號(hào)峰為已知峰），故選擇該峰作為參照峰 （S）建立香薷藥材HPLC指紋圖譜的共有模式，見圖3。

圖3 12批樣品HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

2.5.4 相似度分析 將12批不同香薷藥材HPLC指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A版）中以對照指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果見表6，各批次間相似度均在0.96以上，表明不同批次間相似度良好。

表6 12批樣品相似度Tab.6 Similarities of twelve batches of samples

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品處理方法考察 根據(jù)2015版 《中國藥典》［14］中對香薷的記載，香薷的主要成分為揮發(fā)油類，采用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行提取，但揮發(fā)油類成分易揮發(fā)，穩(wěn)定性較差，使用黃酮類作為香薷藥材指紋圖譜考察主要因素更為適宜。該成分提取方法多為超聲輔助提取和回流提?。?5-18］，本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)，優(yōu)選出香薷黃酮最佳提取工藝為溶于95%乙醇，浸泡1 h，超聲45 min，方法簡便，時(shí)間短，提取效率高。

3.2 色譜條件考察［19］本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-磷酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液、乙腈-冰醋酸水溶液等洗脫系統(tǒng)，以指標(biāo)成分色譜峰作為參考指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水時(shí)分離程度最佳，且保留時(shí)間符合要求。

本實(shí)驗(yàn)選取不同產(chǎn)地12批樣品，前期采用TLC技術(shù)初步定性，大致確定香薷藥材中含有咖啡酸、蘆丁、芹菜苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、山柰酚、黃芩素-7-甲醚等成分，因此建立了8種成分的HPLC指紋圖譜，但由于山柰酚含有量極低，難以準(zhǔn)確定量，故最終以7種成分作為檢識(shí)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)尚存在鮮品數(shù)量較少、飲片與鮮品對比不夠顯著的不足，亟待進(jìn)一步研究分析。