便攜式牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

楊 彪 王 凱 韓天宇 朱新華 郭文川,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院， 陜西楊凌 712100； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西楊凌 712100)

0 引言

牛乳是人類利用最多的動(dòng)物乳，占乳品消費(fèi)量的95%[1]。蛋白質(zhì)含量是牛乳最重要的品質(zhì)指標(biāo)之一，因此備受牛乳生產(chǎn)者、加工者和消費(fèi)者的關(guān)注。文獻(xiàn)[2]規(guī)定：生鮮乳蛋白質(zhì)含量(質(zhì)量比)應(yīng)在2.8 g/(100 g)以上。因而檢測(cè)牛乳中的蛋白質(zhì)含量成為牛乳品質(zhì)檢測(cè)的一個(gè)常規(guī)項(xiàng)目。文獻(xiàn)[3]中規(guī)定了兩種牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法，分別是凱氏定氮法和分光光度法。雖然這兩種方法具有檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定和檢測(cè)精確的優(yōu)點(diǎn)，但所需儀器昂貴、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、需要專業(yè)人員操作，而且不能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

為了探索新型的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外研究者分別采用近紅外光譜法[4-6]、中紅外光譜法[7-8]、拉曼光譜法[9-10]、激光散射法[11]、紫外分光光度法[12]、超聲波法[13]、杜馬斯燃燒法[14]、染色法[15]、介電特性法[16-18]等檢測(cè)乳中的蛋白質(zhì)含量，取得了較好的研究結(jié)果。其中超聲波技術(shù)的檢測(cè)精度有限[19]，而其他檢測(cè)技術(shù)所需的儀器依舊比較龐大和昂貴，也僅局限于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。雖然目前有快速的乳成分檢測(cè)儀，例如MilkoScan FT+[20]、MilkoScan FT6000[8](丹麥FOSS分析儀器有限公司)，Lactoscan Milk Analyzer[21](保加利亞Milkotronic有限公司)等，但同樣存在儀器價(jià)格昂貴，清洗儀器費(fèi)時(shí)，只能用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等缺點(diǎn)。因此，設(shè)計(jì)一種價(jià)格低廉、檢測(cè)迅速、結(jié)果可靠、能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的便攜式牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀對(duì)于牛乳生產(chǎn)、加工和消費(fèi)均有重要的作用。

由于考馬斯亮藍(lán)G-250染料中的疏水基團(tuán)在酸性(磷酸)條件下與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)具有親和力，通過疏水作用與蛋白質(zhì)相結(jié)合，使得反應(yīng)后的混合溶液在595 nm處有最大吸光度[22]，基于此，本文以單片機(jī)為控制器，設(shè)計(jì)一種便攜式牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀，并對(duì)檢測(cè)儀的性能進(jìn)行驗(yàn)證。

1 便攜式牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀設(shè)計(jì)

1.1 硬件設(shè)計(jì)

圖1是牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀的硬件結(jié)構(gòu)圖。該檢測(cè)儀主要由單片機(jī)、光源模塊、光傳感器模塊、電源模塊和輸入輸出模塊組成。單片機(jī)負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理，并控制系統(tǒng)中的其他模塊。光源模塊負(fù)責(zé)產(chǎn)生光強(qiáng)穩(wěn)定且波長(zhǎng)為590～595 nm的入射光；光傳感器模塊將穿過待測(cè)樣本的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，并將攜帶有牛乳蛋白質(zhì)含量相關(guān)信息的數(shù)字信號(hào)傳送給單片機(jī)；電源模塊為整個(gè)系統(tǒng)提供穩(wěn)定的電源；輸入輸出模塊完成輸入信息的處理，并將光傳感器的檢測(cè)數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)含量檢測(cè)值反饋給用戶。

圖1 牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀的硬件結(jié)構(gòu)框圖Fig.1 Structure diagram of portable milk protein content detector

1.1.1單片機(jī)

本設(shè)計(jì)采用STC89C52單片機(jī)作為控制核心，該單片機(jī)具有512B的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)器和8KB的flash可擦寫程序存儲(chǔ)器。與之配套的電路包括時(shí)鐘電路、復(fù)位電路、串口通信電路。時(shí)鐘電路采用11.059 2 MHz的晶振，串口通信電路采用CH340芯片，用于實(shí)現(xiàn)單片機(jī)與計(jì)算機(jī)之間的數(shù)據(jù)交換。單片機(jī)的引腳分配如圖2所示。

圖2 單片機(jī)引腳分配圖Fig.2 Pin assignment diagram of single-chip micro-computer

1.1.2光源模塊

由于考馬斯亮藍(lán)G-250染料與牛乳中的蛋白質(zhì)反應(yīng)后，在595 nm處有最大吸收峰，因此光源模塊的作用是輸出波長(zhǎng)為595 nm的光。本設(shè)計(jì)采用XP-E 3533型LED燈珠(美國(guó)CREE公司)作為光源。該燈珠工作電壓為2.0～2.5 V，工作電流350～500 mA，輸出光的波長(zhǎng)范圍為590～595 nm，可滿足設(shè)計(jì)需求。

1.1.3光傳感器模塊

采用GY-30型數(shù)字光照傳感器模塊檢測(cè)透射光照度。該傳感器模塊采用分辨率為16位的數(shù)字型光傳感器芯片BH1750FVI檢測(cè)透射光照度，其響應(yīng)波段為400～700 nm，峰值響應(yīng)波段為500～600 nm，輸入電壓為3～5 V，滿足設(shè)計(jì)要求。該傳感器模塊共有5個(gè)接口，其中：VCC和GND用于供電；ADDR為器件選擇端口，低電平有效，接GND即可；SCL、SDA分別為串行時(shí)鐘線和串行數(shù)據(jù)線，分別與單片機(jī)的P1.0、P1.1接口相連接。單片機(jī)與傳感器模塊之間通過I2C協(xié)議通信，電路原理圖如圖3所示。

圖3 光傳感器模塊電路原理圖Fig.3 Schematic of used light sensor model

1.1.4電源模塊

為了減輕儀器質(zhì)量，提高儀器便攜性，采用18650型鋰電池配合DD06CVSA電源管理模塊為整個(gè)儀器供電。DD06CVSA電源管理模塊可以將鋰電池輸出的3.6～4.2 V電壓轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的5.0 V，并輸出2.1 A的電流。

1.1.5輸入輸出模塊

綜合考慮儀器的功能和便攜性，本檢測(cè)儀只設(shè)計(jì)了兩個(gè)按鍵，分別是開關(guān)鍵和復(fù)位鍵。顯示器為液晶顯示器LCD1602，顯示器的電路原理圖如圖4所示，其數(shù)據(jù)線與單片機(jī)P0.0～P0.7接口相連，控制線RS、RW、E分別與單片機(jī)P2.0、P2.1、P2.2相連，電阻R1用于控制顯示器的亮度。

圖4 顯示器電路原理圖Fig.4 Schematic of used display

1.1.6整體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

檢測(cè)儀整體結(jié)構(gòu)用SolidWorks軟件設(shè)計(jì)，尺寸為120 mm×90 mm×65 mm，外殼用3D打印技術(shù)制作，耗材采用PLA(聚乳酸)。牛乳與考馬亮藍(lán)的混合溶液盛于比色皿內(nèi)，而比色皿置于設(shè)計(jì)的比色皿支架上。圖5是便攜式牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀樣機(jī)。

圖5 便攜式牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀樣機(jī)Fig.5 Prototype of developed portable milk protein content detector1.外殼 2.顯示器 3.單片機(jī) 4.比色皿支架 5.待測(cè)樣本

1.2 軟件設(shè)計(jì)

本檢測(cè)儀的軟件在Keil μVision4中使用C51語(yǔ)言編寫。主要包括主函數(shù)以及光照度數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、蛋白質(zhì)含量計(jì)算和顯示子函數(shù)等。其中，主函數(shù)，主要完成光傳感器模塊等主要元器件的初始化、協(xié)調(diào)各子函數(shù)運(yùn)行等；光照度數(shù)據(jù)采集子函數(shù)和數(shù)據(jù)預(yù)處理子函數(shù)，主要完成光傳感器與單片機(jī)數(shù)據(jù)交換和光照度數(shù)據(jù)的預(yù)處理；蛋白質(zhì)含量計(jì)算子函數(shù)負(fù)責(zé)根據(jù)光傳感器輸出的數(shù)據(jù)計(jì)算出樣本的蛋白質(zhì)含量；顯示子函數(shù)負(fù)責(zé)將檢測(cè)結(jié)果顯示至顯示器?？刂栖浖鞒倘鐖D6所示。

圖6 檢測(cè)儀軟件流程Fig.6 Program flow chart of developed detector

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 材料

試驗(yàn)用牛乳樣本購(gòu)自陜西省楊凌區(qū)某牛場(chǎng)，奶牛品種為“荷斯坦”。每天隨機(jī)采集4～6頭奶牛的牛乳，共采集35份牛乳樣本。樣本采集后30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室置于4℃環(huán)境下冷藏。試驗(yàn)前將樣本取出恢復(fù)至室溫(25℃)時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。所有樣本在采集后10 h內(nèi)完成試驗(yàn)。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1牛乳蛋白質(zhì)含量測(cè)量

牛乳樣本蛋白質(zhì)含量用Kjeltec 8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀(丹麥FOSS分析儀器有限公司)測(cè)量，具體測(cè)量方法參考文獻(xiàn)[3]。

2.2.2考馬斯亮藍(lán)溶液配制

使用FA2104N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)準(zhǔn)確稱量100 mg的粉末狀考馬斯亮藍(lán)G-250染料(安徽酷爾生物工程有限公司)，將其加入50 mL 95%的酒精中，待充分溶解后，再向該酒精溶液中加入100 mL 85%的磷酸，用蒸餾水將反應(yīng)后的溶液稀釋并定容至1 000 mL，最后用中性濾紙過濾，從而得到考馬斯亮藍(lán)溶液[23]。

2.2.3牛乳-考馬斯亮藍(lán)混合液制備

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量為0～0.18 g/(100 g)時(shí)，考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)精度較高[24]。由于牛乳中蛋白質(zhì)含量通常為2.8～3.6 g/(100 g)，因此用去離子水對(duì)牛乳樣本進(jìn)行稀釋，稀釋比例為1∶50。進(jìn)而用移液槍吸取5 mL稀釋后的牛乳和20 mL考馬斯亮藍(lán)溶液放入試管中搖勻，靜置1 min后得到牛乳-考馬斯亮藍(lán)混合液。

2.2.4透射光照度測(cè)量

打開牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀的電源，預(yù)熱2 min。然后用移液槍取適量的牛乳-考馬斯亮藍(lán)混合溶液加入10 mm比色皿(12.5 mm×12.5 mm×45 mm) 中，將比色皿放入檢測(cè)儀的比色皿座內(nèi)，蓋上比色皿蓋和儀器蓋，觀察并記錄顯示屏上給出的透射光照度。每個(gè)樣品重復(fù)3次，3次測(cè)量結(jié)果的平均值作為該樣品的測(cè)量結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果分析與建模

圖7是35個(gè)牛乳樣本的蛋白質(zhì)含量與由檢測(cè)儀測(cè)得的透射光照度之間的關(guān)系。由圖7可知，透射光照度隨牛乳中蛋白質(zhì)含量的增加而減小，說明牛乳樣本中的蛋白質(zhì)含量越高，對(duì)波長(zhǎng)595 nm處的光的吸收作用越強(qiáng)，而透射光照度越小[25]。對(duì)牛乳中的蛋白質(zhì)含量與透射光照度進(jìn)行線性擬合，決定系數(shù)為0.872，可見二者相關(guān)性較好，擬合關(guān)系式為

P=-0.004 78L+3.27 (R2=0.872)

(1)

式中P——蛋白質(zhì)含量，g/(100 g)

L——透射光照度，lx

圖7 牛乳蛋白質(zhì)含量與透射光照度之間的關(guān)系Fig.7 Relationship between protein content of milk and illuminance of transmitted light

根據(jù)式(1)中牛乳的蛋白質(zhì)含量與透射光照度之間的關(guān)系調(diào)整程序，使得該檢測(cè)儀直接輸出基于透射光照度計(jì)算得到的牛乳蛋白質(zhì)含量。

4 儀器性能檢驗(yàn)

為了對(duì)設(shè)計(jì)的便攜式牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀的性能進(jìn)行驗(yàn)證，另取21份牛乳樣本分別用凱氏定氮法和本儀器測(cè)量其蛋白質(zhì)含量，測(cè)量結(jié)果如圖8所示。圖8說明，測(cè)量結(jié)果緊密地分布在45°線的附近。同凱氏定氮法的測(cè)量結(jié)果相比，當(dāng)牛乳蛋白質(zhì)含量在2.54～2.95 g/(100 g)范圍內(nèi)時(shí)，本檢測(cè)儀的絕對(duì)誤差范圍是±0.08 g/(100 g)，平均絕對(duì)誤差為0.05 g/(100 g)?？梢姳緝x器對(duì)于牛乳中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)具有良好的檢測(cè)精度。此外，該儀器測(cè)量每個(gè)樣品蛋白質(zhì)含量的時(shí)間小于2 s。

5 結(jié)論

(1)基于考馬斯亮藍(lán)染色法原理設(shè)計(jì)了由單片機(jī)、光源模塊、光傳感器模塊、電源模塊和輸入輸出模塊組成的牛乳蛋白質(zhì)含量檢測(cè)儀硬件系統(tǒng)，用C51語(yǔ)言編寫了儀器的控制軟件，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)透射光照度和牛乳蛋白質(zhì)含量的功能。

(2)透射光照度與蛋白質(zhì)含量之間具有良好的線性關(guān)系，線性決定系數(shù)為0.872。

(3)對(duì)本儀器的檢測(cè)性能驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，與基于凱氏定氮法測(cè)量牛乳中蛋白質(zhì)含量的結(jié)果相比，本檢測(cè)儀的絕對(duì)誤差范圍是±0.08 g/(100 g)，平均絕對(duì)誤差為0.05 g/(100 g)，可以較準(zhǔn)確地檢測(cè)牛乳中的蛋白質(zhì)含量。此外，該檢測(cè)儀的檢測(cè)時(shí)間小于2 s。