接種比例和接種物馴化對(duì)榨汁橙渣厭氧發(fā)酵的影響

席 江 艾 平 袁 蕭 龍 燕 張衍林

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 武漢 430070； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所， 成都 610041)

0 引言

2016年全球橙種植面積超過(guò)3.96×106hm2，總產(chǎn)量超過(guò)7×107t，而中國(guó)橙產(chǎn)量位于全球第二，產(chǎn)量超過(guò)8×106t，占全球橙產(chǎn)量的11.5%[1]。全球30%～50%的柑橘被用于鮮食，剩余部分被用于加工，主要生產(chǎn)果汁、果醬、果膠和其他食品[2]，柑橘加工后殘?jiān)馁|(zhì)量達(dá)到了鮮果的50%～60%，主要包含皮、種子和果肉殘?jiān)黐3]。我國(guó)每年會(huì)產(chǎn)生超過(guò)5×106t柑橘?gòu)U渣，除去一小部分被用于果膠的提取和動(dòng)物飼養(yǎng)，絕大多數(shù)廢渣被直接丟棄或填埋[4]。榨汁橙渣富含果膠等有機(jī)質(zhì)，適宜采用厭氧生物降解手段進(jìn)行處理，既環(huán)保，又能回收能源，發(fā)酵之后的沼渣還可以作為一種土壤改良劑，替代部分化肥的使用，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，緩解土壤板結(jié)[5]。

榨汁橙渣易酸化的特性和橙皮中含有對(duì)微生物有抑制作用的精油常會(huì)導(dǎo)致厭氧發(fā)酵不正?；虍a(chǎn)氣率較低。FAGBOHUNGBE等[6]采用3～3.26的接種比例(接種物與原料的揮發(fā)性固體質(zhì)量比，Inoculum and substrate ratio， ISR)開(kāi)展橙皮的厭氧發(fā)酵，盡管加入了生物炭，但得到最高甲烷累積產(chǎn)率僅154 mL/g，發(fā)酵過(guò)程中均出現(xiàn)了不同程度的停滯。SANJAYA等[7]研究了中溫條件下，橙的種子、果皮和果肉的甲烷累積產(chǎn)率，選擇的ISR為4，橙皮的甲烷累積產(chǎn)率只有48.23 mL/g，研究認(rèn)為是因精油中檸檬烯等一些有芳香味的化合物對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)生了抑制，可能使用的接種物對(duì)橙皮適應(yīng)性較差而同時(shí)添加量又不足，才造成厭氧發(fā)酵異常和產(chǎn)氣率較低。WIKANDARI等[8]在30 mL厭氧發(fā)酵體系中添加20 mL接種物，仍只得到131 mL/g的甲烷累積產(chǎn)率，說(shuō)明以這類(lèi)廢棄物為發(fā)酵原料可能需要更高的ISR。還有一些研究通過(guò)水蒸氣蒸餾[3]、溶劑萃取[8]、汽爆[9]和生物降解[4]等預(yù)處理手段以促進(jìn)橙皮的厭氧發(fā)酵。FORGCS等[9]通過(guò)汽爆預(yù)處理柑橘榨汁渣，使甲烷累積產(chǎn)率提高了426%, 但預(yù)處理前的甲烷累積產(chǎn)率僅102 mL/g，可能是因原料添加量較高(接種物添加較少)而導(dǎo)致預(yù)處理前甲烷累積產(chǎn)率較低。一些其他的預(yù)處理如生物預(yù)處理之后甲烷累積產(chǎn)率也只有176.05 mL/g[4]，且沒(méi)有通過(guò)優(yōu)化厭氧發(fā)酵體系來(lái)充分挖掘產(chǎn)甲烷潛力。對(duì)于榨汁橙渣厭氧發(fā)酵的研究，多集中于不同預(yù)處理的優(yōu)化，這些預(yù)處理均需要額外的能耗或化學(xué)試劑添加，而不同接種比例和接種物馴化對(duì)榨汁橙渣厭氧發(fā)酵影響的研究相對(duì)較少。

因此，本文以榨汁橙渣為厭氧發(fā)酵原料，通過(guò)監(jiān)測(cè)不同ISR條件下榨汁橙渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷量、pH值和揮發(fā)酸含量，比較接種物和發(fā)酵結(jié)束后厭氧發(fā)酵體系中細(xì)菌和古菌群落組成的變化，系統(tǒng)分析榨汁橙渣厭氧發(fā)酵的規(guī)律，同時(shí)，通過(guò)監(jiān)測(cè)馴化后接種物的厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)氣量，分析通過(guò)馴化接種物促進(jìn)榨汁橙渣厭氧發(fā)酵的有效性和可行性，為榨汁橙渣厭氧發(fā)酵及其預(yù)處理優(yōu)化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與接種物

實(shí)驗(yàn)用榨汁橙渣(Orange pressing waste, OPR)取自“天使之橙”鮮榨橙汁自助販賣(mài)機(jī)，手動(dòng)分選出橙皮渣(Orange peel waste, OPW)和橙肉渣(Orange pulp waste, OPU)，OPW與OPU鮮質(zhì)量比為2.39∶1，經(jīng)粉碎和過(guò)10目篩后，抽真空-20℃分別保存?zhèn)溆?。接種物取自四川省德陽(yáng)市正常運(yùn)行的集中供氣工程，該工程以豬糞為發(fā)酵原料。接種物取回后裝入5 L厭氧發(fā)酵瓶中，35℃水浴放置一段時(shí)間直到不再產(chǎn)氣為止。OPW、OPU和接種物的總固體(Total solid, TS)、揮發(fā)性固體(Volatile solid, VS)和檸檬烯含量見(jiàn)表1。

表1 榨汁橙皮渣、橙肉渣和接種物理化特性Tab.1 Characteristics of OPW, OPU and inoculum

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵原料為夏橙榨汁渣，該夏橙產(chǎn)自湖北省宜昌市秭歸縣，手動(dòng)剝下橙皮，橙肉渣為橙肉經(jīng)飛利浦HR871/00型榨汁機(jī)榨汁后的殘?jiān)?，夏橙橙皮渣和橙肉渣VS質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.85%和13.94%，OPW與OPU鮮質(zhì)量比為1.97∶1，經(jīng)粉碎和10目篩過(guò)篩后，抽真空-20℃分別保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

厭氧發(fā)酵裝置采用全自動(dòng)甲烷潛力測(cè)試系統(tǒng)(Bioprocess AMPTSII)，發(fā)酵瓶容積為400 mL，沼氣通過(guò)3 mol/L NaOH溶液吸收后進(jìn)入流量自動(dòng)記錄裝置，裝置將甲烷產(chǎn)氣量自動(dòng)換算成標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)并記錄，厭氧發(fā)酵裝置示意圖見(jiàn)圖1。每隔1 d取4 mL發(fā)酵液用于pH值和揮發(fā)酸(Volatile fatty acids, VFAs)測(cè)量。厭氧發(fā)酵溫度為35℃，ISR設(shè)置見(jiàn)表2，每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)重復(fù)。采用修正的Gompertz 模型描述厭氧發(fā)酵過(guò)程[10]，模型公式為

式中p——t時(shí)刻的單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量，mL/g

p0——單位揮發(fā)性固體最大產(chǎn)甲烷潛力，mL/g

Rmax——單位揮發(fā)性固體最大產(chǎn)甲烷速率，mL/(g·d)

λ——停滯期，d

t——實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間，d

圖1 厭氧發(fā)酵裝置示意圖Fig.1 Experimental sketch of anerobic digestion device1.液樣取樣口 2.厭氧發(fā)酵瓶 3.水浴鍋 4.導(dǎo)氣管 5.CO2吸收瓶 6.流量自動(dòng)記錄裝置

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用相同厭氧發(fā)酵裝置，ISR分別為8、6、4和2，每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)重復(fù)，固定發(fā)酵原料總VS質(zhì)量為2 g。

1.3 參數(shù)測(cè)量方法

TS和VS含量采用差重法測(cè)量，取10 g樣品，TS測(cè)量在(105±5)℃干燥24 h，VS含量測(cè)量在550～600℃馬弗爐中灼燒4 h； pH值采用梅特勒 FE28 pH計(jì)進(jìn)行測(cè)量; VFAs含量的測(cè)量使用島津GC-2030型氣相色譜儀(日本)，檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器，色譜柱為IntertCap WAX型毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度200℃，柱箱溫度95℃保持2 min，以10℃/min升溫至160℃，繼續(xù)以400℃/min升溫至240℃，保持5 min。檸檬烯含量測(cè)量使用島津GCMS-TQ8050型三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，模式選擇Q3Scan，色譜柱使用Rtx-5MS型毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫箱溫度50℃保持1 min，以10℃/min的速率上升到280℃，保持5 min，離子源溫度200℃。

1.4 細(xì)菌和古菌多樣性分析

取樣品10 mL，于-80℃下保存。使用E.Z.N.A.soil試劑盒(美國(guó)Omega Bio-tek公司)進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)，檢測(cè)合格后用引物Arch344F(5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3′)和Arch915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)，338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，數(shù)據(jù)進(jìn)行OUT抽平后進(jìn)行多樣性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同ISR對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷規(guī)律的影響

2.1.1甲烷日產(chǎn)氣率

ISR為8、6、4的處理表現(xiàn)出相似的產(chǎn)甲烷規(guī)律，見(jiàn)圖2。第1天達(dá)到第1個(gè)產(chǎn)氣高峰之后產(chǎn)氣量下降，隨后上升達(dá)到第2個(gè)產(chǎn)氣高峰，且第2個(gè)產(chǎn)氣高峰的日產(chǎn)氣率高于第1個(gè)產(chǎn)氣高峰。但在第1個(gè)產(chǎn)氣高峰之后的產(chǎn)氣下降幅度和時(shí)長(zhǎng)有所區(qū)別，ISR為8、6、4分別在第3、3、4天達(dá)到甲烷日產(chǎn)氣率相對(duì)低點(diǎn)，分別為28.15、21.05、4.58 mL/g，接種比例高的先達(dá)到相對(duì)低點(diǎn)，同時(shí)甲烷日產(chǎn)氣率也較高，隨后分別在第5、6、9天分別達(dá)到第2個(gè)產(chǎn)甲烷高峰，分別為52.9、49.8、41.9 mL/g，接種比例高的先達(dá)到第2個(gè)產(chǎn)氣高峰，且甲烷日產(chǎn)氣率也較高。ISR為2的處理發(fā)生了可逆的酸化，在第1天達(dá)到第1個(gè)產(chǎn)氣高峰之后，產(chǎn)氣迅速停滯，直到第8天才恢復(fù)產(chǎn)氣，并在第10天達(dá)到第2個(gè)產(chǎn)氣高峰，甲烷日產(chǎn)氣率達(dá)到23.48 mL/g。這種現(xiàn)象反映了產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷速率的失衡，產(chǎn)酸產(chǎn)生的VFAs積累又導(dǎo)致pH值的下降，進(jìn)一步抑制產(chǎn)甲烷過(guò)程[11]，在這個(gè)ISR下厭氧發(fā)酵不能正常進(jìn)行。

2.1.2甲烷累積產(chǎn)率

從圖2可以看出，ISR為8和6的甲烷累積產(chǎn)率相近，分別為320.0 mL/g和304.9 mL/g，說(shuō)明不能通過(guò)進(jìn)一步增加接種物量的方式來(lái)提高原料產(chǎn)氣率。這個(gè)數(shù)據(jù)與CALABRO等[12]、RUIZ等[5]和NEGRO等[13]分別報(bào)道的361、357.3、285 mL/g相近，結(jié)果略低于KAPRAJU等[14]報(bào)道的490 mL/g，這種差異可能是原料理化特性差異造成的。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果高于FORGCS等[9]報(bào)道的102 mL/g和FAGBOHUNGBE等[6]報(bào)道的165.9 mL/g，這可能是由于他們添加的接種物量不足而導(dǎo)致原料沒(méi)有被充分利用。

圖2 ISR為2～8的甲烷日產(chǎn)氣率和累積產(chǎn)率Fig.2 Daily and cumulative methane production of ISR 2～8

ISR為4和ISR為2的甲烷累積產(chǎn)率低于ISR為8和ISR為6時(shí)的數(shù)值。ISR為4的甲烷累積產(chǎn)率為242.6 mL/g，是ISR為8和6的甲烷累積產(chǎn)率的75.8%和79.6%。而ISR為2的甲烷累積產(chǎn)率僅為111.4 mL/g，是ISR為8和6的甲烷累積產(chǎn)率的34.8%和36.5%。從累積產(chǎn)甲烷的曲線可以看出，第1天之后厭氧發(fā)酵進(jìn)入停滯階段，尤其是ISR為2時(shí)的停滯期長(zhǎng)達(dá)7 d。

根據(jù)表1和表2可以計(jì)算出添加到厭氧發(fā)酵體系中檸檬烯的質(zhì)量濃度為490 mg/L，這個(gè)濃度在中溫條件下并不會(huì)對(duì)厭氧發(fā)酵體系產(chǎn)生顯著抑制[12]， ISR為4和2的處理的累積產(chǎn)甲烷量低，主要是因?yàn)榻臃N物量較少，不能充分利用底物。

2.1.3pH值和VFAs含量

厭氧發(fā)酵系統(tǒng)pH值的變化與VFAs(乙酸、丙酸、丁酸和異丁酸含量之和)積累呈負(fù)相關(guān)(圖3)。ISR為8、6、4的處理在第2天揮發(fā)酸質(zhì)量濃度達(dá)到峰值，分別為1 445.89、1 806.05、2 067.37 mg/L，隨接種比例增加，揮發(fā)酸質(zhì)量濃度峰值降低，在第10天已經(jīng)檢測(cè)不出揮發(fā)酸。ISR為2的處理是在第4天揮發(fā)酸質(zhì)量濃度才達(dá)到峰值2 201.92 mg/L，呈先上升再下降的規(guī)律，在第10天揮發(fā)酸質(zhì)量濃度仍達(dá)到279.24 mg/L，直到第12天才檢測(cè)不出揮發(fā)酸。同時(shí)，隨著VFAs含量的減少，pH值在逐漸上升。產(chǎn)甲烷的最適宜pH值是6.8～8.5[15]， ISR為8和6的處理pH值一直高于7。ISR為4的處理在第2天pH值低于6.8，此后逐步恢復(fù)到7以上。而ISR為2 的處理在第6天之前pH值也一直維持在6.8以下，直到第8天 pH值才恢復(fù)到6.8以上，同時(shí)產(chǎn)甲烷也恢復(fù)。由于榨汁橙渣pH值在3～4[3]，其低pH值和易酸化特性是影響厭氧發(fā)酵效果的一個(gè)重要因素，通過(guò)增加接種量可以有效提高發(fā)酵系統(tǒng)的緩沖能力，防止發(fā)酵過(guò)程中pH值大幅下降。

圖3 ISR為2～8 時(shí)pH值和揮發(fā)酸含量變化圖Fig.3 Changes of pH and VFAs of ISR 2～8

2.2 不同ISR對(duì)微生物多樣性的影響

2.2.1細(xì)菌群落組成

由圖4可知，接種物中主要是硬壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)，相對(duì)豐度分別達(dá)到86.96%、4.39%和4.48%，放線菌門(mén)(Actinobacteria)、Atribacteria和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)相對(duì)豐度較低，分別為2.26%、0.52%和0.32%。其他的一些研究也發(fā)現(xiàn)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中硬壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群[16]，放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)也常見(jiàn)于產(chǎn)甲烷的厭氧發(fā)酵裝置和廢水處理工程，但它們?cè)诋a(chǎn)甲烷過(guò)程中的作用并不清楚[15]。

圖4 不同ISR發(fā)酵前后細(xì)菌群落組成Fig.4 Composition of bacterial community before and after anaerobic digestion

在門(mén)水平，ISR 為4、6和8的沼渣中硬壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度最高，分別為79.90%～82.86%和3.33%～11.66%，LI等[17]發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)門(mén)的細(xì)菌在纖維素的降解中發(fā)揮重要作用；Atribacteria和綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度均高于接種物，但相對(duì)豐度隨ISR 下降而降低；變形菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度低于接種物；Cloacimonetes門(mén)則只存在于榨汁橙渣發(fā)酵后的沼渣中，這類(lèi)細(xì)菌被認(rèn)為與氨基酸、丙酸、丁酸以及纖維素的降解有關(guān)[18]，且相對(duì)豐度隨接種比例降低而下降。ISR為2沼渣的細(xì)菌群落組成與其他處理相比，則表現(xiàn)較大差異，硬壁菌門(mén)相對(duì)豐度下降到65.10%，變形菌門(mén)相對(duì)豐度上升到19.09%，綠彎菌門(mén)和Cloacimonetes門(mén)未檢測(cè)到。

在綱水平，ISR為4、6、8的沼渣中細(xì)菌群落組成相較接種物存在明顯差異，表現(xiàn)為梭菌綱(Clostridia)相對(duì)豐度下降到57.74%～61.7%，而同屬于硬壁菌門(mén)的芽孢桿菌綱(Bacilli)相對(duì)豐度增加到6.06%～8.20%，擬桿菌綱(Bacteroidia)相對(duì)豐度則增加到9.65%～13.00%。梭菌綱和擬桿菌綱的細(xì)菌被認(rèn)為主要參與水解和產(chǎn)酸過(guò)程[19]。同樣地，ISR 為2沼渣中芽孢桿菌綱相對(duì)豐度低于其他處理，僅1.88%，這可能導(dǎo)致底物水解產(chǎn)酸過(guò)程受影響，但β-變形菌綱(Betaproteobacteria)豐度高于其他處理，達(dá)到15.91%。

在門(mén)水平和綱水平，ISR為4、6和8與接種物的細(xì)菌群落均有明顯差異，可能因?yàn)榻臃N物取自以豬糞為發(fā)酵原料的沼氣工程，豬糞和榨汁橙渣的理化特性差異導(dǎo)致其最適宜的細(xì)菌群落組成存在差異，而經(jīng)過(guò)一輪發(fā)酵后的群落組成可能更適應(yīng)榨汁橙渣的厭氧發(fā)酵。ISR 為2的沼渣在門(mén)水平和綱水平與其他處理的差異可能是因?yàn)槠鹗冀臃N物數(shù)量不足，發(fā)酵后期菌群已經(jīng)失調(diào)。

WJD-0.75電動(dòng)鏟運(yùn)機(jī)是武山銅礦井下主要采掘設(shè)備之一，承擔(dān)南、北礦帶大部分礦石及廢石鏟裝任務(wù)。電纜托輥是電動(dòng)鏟運(yùn)機(jī)運(yùn)行時(shí)實(shí)現(xiàn)電纜順利收放的裝置［1］，但在使用過(guò)程中，由于電纜托輥磨損、軸承損壞或受到外部撞擊，則需更換托輥。在實(shí)踐更換時(shí)，維修難度大、維修時(shí)間長(zhǎng)，特別是更換水平托輥時(shí)，還需多人配合才能完成，影響井下作業(yè)點(diǎn)正常生產(chǎn)組織。因此，通過(guò)對(duì)電動(dòng)鏟運(yùn)機(jī)電纜托輥安裝結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，提出了托輥支架的結(jié)構(gòu)改進(jìn)措施。

2.2.2古菌群落組成

由圖5可知，接種物中主要存在4個(gè)屬的產(chǎn)甲烷菌，分別是Methanosaeta、Methanosarcina、Methanospirillum和Methanobacterium，其相對(duì)豐度分別為72.58%、5.15%、16.06%和1.73%。其中，Methanosaeta和Methanosarcina同屬于Methanosarcinales目，前者為專性乙酸營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn)甲烷古菌，后者則可以通過(guò)CO2還原、甲基裂解和乙酸發(fā)酵途徑產(chǎn)甲烷[20]，而2/3甲烷的產(chǎn)量是來(lái)自乙酸的裂解[21]；Methanospirillum和Methanobacterium分屬M(fèi)ethanomicrobiales和Methanobacteriales目，均為氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌[20]。發(fā)酵后古菌群落組成與接種物相比已經(jīng)有所變化，在接種物中Methanospirillum的相對(duì)豐度較高，而Methanosarcina相對(duì)豐度較低，可能與發(fā)酵原料以及發(fā)酵系統(tǒng)中pH值有關(guān)，因?yàn)榻臃N物取自以豬糞為發(fā)酵原料的沼氣工程，豬糞的pH值較橙榨汁渣高，而變化后的古菌群落組成可能更適應(yīng)榨汁橙渣的厭氧發(fā)酵。

圖5 不同接種物量發(fā)酵前后古菌群落組成Fig.5 Composition of archaea community before and after anaerobic digestion

總體上看，Methanosaeta和Methanosarcina乙酸營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn)甲烷古菌的累積相對(duì)豐度隨ISR的降低而提高，ISR為2條件下，這兩個(gè)屬的產(chǎn)甲烷古菌相對(duì)豐度達(dá)到90.17%。這與厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中揮發(fā)酸的積累隨ISR降低而提高的趨勢(shì)一致，而Methanospirillum和Methanobacterium氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌的相對(duì)豐度隨ISR降低而下降，ISR為2條件下，這兩個(gè)屬的產(chǎn)甲烷古菌相對(duì)豐度合計(jì)僅為6.92%。這可能與底物被大量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)酸，而這類(lèi)古菌可利用底物量下降有關(guān)。

單獨(dú)來(lái)看，乙酸營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn)甲烷古菌中Methanosaeta相對(duì)豐度隨ISR降低而降低，Methanosarcina相對(duì)豐度隨ISR降低而提高，在ISR為2條件下，相對(duì)豐度分別為24.45%和66.72%。這可能是因?yàn)榍罢咦钸m生長(zhǎng)的pH值范圍(7.0～7.3)較后者(6.5～7.8)更窄[22]，而ISR為2的最低pH值達(dá)到6.57，不適宜Methanosaeta生長(zhǎng)，而Methanosarcina仍能適應(yīng)。同樣地，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌中Methanospirillum相對(duì)豐度隨ISR降低而降低，Methanobacterium相對(duì)豐度隨ISR降低而提高，在ISR為2條件下，相對(duì)豐度分別為1.71%和5.21%。這可能是因?yàn)榍罢叩淖钸m生長(zhǎng)的pH值范圍(7.0～7.8)較后者(5.6～8.6)更窄[22]。

2.3 接種物馴化對(duì)厭氧發(fā)酵的影響

厭氧發(fā)酵體系中微生物群落組成經(jīng)過(guò)一輪厭氧發(fā)酵，已經(jīng)得到了優(yōu)化，這種改變的驅(qū)動(dòng)力是發(fā)酵原料特性及厭氧發(fā)酵的條件[5]。為了進(jìn)一步研究接種物馴化后對(duì)榨汁橙渣厭氧發(fā)酵效率的提升，待第1輪厭氧發(fā)酵停止后，在發(fā)酵裝置中加入與第1輪相同的原料量進(jìn)行第2輪發(fā)酵，在第2輪厭氧發(fā)酵停止后再加入相同原料量進(jìn)行第3輪發(fā)酵，監(jiān)測(cè)厭氧發(fā)酵的甲烷產(chǎn)量。

ISR為8和ISR為6的3輪厭氧發(fā)酵的甲烷累積產(chǎn)率見(jiàn)圖6a。接種物馴化后甲烷累積產(chǎn)率沒(méi)有得到進(jìn)一步提高，說(shuō)明馴化前的微生物數(shù)量是足夠的，原料在發(fā)酵過(guò)程中被充分降解和利用。隨著微生物對(duì)底物適應(yīng)性的提高，產(chǎn)氣效率在逐步提高，說(shuō)明經(jīng)過(guò)馴化，接種物對(duì)橙榨汁渣的適應(yīng)性增強(qiáng)。ISR為8時(shí)第3、2、1輪甲烷累積產(chǎn)率分別為326.6、347.0、320.0 mL/g。從累積產(chǎn)甲烷量來(lái)看，雖然甲烷累積產(chǎn)率并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異，但第3、2、1輪在前4 d產(chǎn)甲烷量占整個(gè)發(fā)酵周期產(chǎn)氣量的95.75%、 83.78%和44.89%，通過(guò)接種物馴化，有效縮短了產(chǎn)氣周期，提高了產(chǎn)氣效率。ISR為6的第3、2、1輪甲烷累積產(chǎn)率分別為326.0、311.3、304.9 mL/g。雖然甲烷累積產(chǎn)率并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異，但同樣地，第3、2、1輪在前4 d產(chǎn)甲烷量占整個(gè)發(fā)酵周期產(chǎn)氣量的93.40%、86.72%和38.03%，有效縮短了產(chǎn)氣周期，提高了產(chǎn)氣效率。ISR為8和6條件下，通過(guò)接種物馴化對(duì)厭氧發(fā)酵促進(jìn)的效果是一致的，這也說(shuō)明ISR為6下微生物數(shù)量相對(duì)榨汁橙渣量是充裕的，通過(guò)接種物馴化可以進(jìn)一步提高厭氧發(fā)酵的效率，而ISR為6較ISR為8時(shí)添加較少的接種物，更具有應(yīng)用價(jià)值。

圖6 ISR為 8、6、4和2時(shí)3輪厭氧發(fā)酵甲烷累積產(chǎn)率Fig.6 Cumulative methane production of ISR 8, 6, 4 and 2 from the first to the third round

ISR為2的3輪厭氧發(fā)酵的甲烷累積產(chǎn)率見(jiàn)圖6c。ISR為2的處理與ISR為4的第2個(gè)重復(fù)較為相似的是對(duì)厭氧發(fā)酵的提升也不顯著，第3、2、1輪甲烷累積產(chǎn)率分別為136.6、117.2、111.4 mL/g。這說(shuō)明在ISR為2條件下，第1輪發(fā)酵結(jié)束后微生物群落組成可能就失衡了，且為不可逆的，僅通過(guò)接種物的馴化不能促進(jìn)榨汁橙渣的厭氧發(fā)酵。

采用修正Gompertz模型擬合的模型參數(shù)見(jiàn)表3。通過(guò)該模型可以很好地描述ISR為8和6的3輪厭氧發(fā)酵過(guò)程(R2>0.99)。從第1到第3輪，最大產(chǎn)甲烷速率Rmax逐步提高，反應(yīng)停滯期λ在逐步縮小，其中第3輪ISR為8和ISR為6的Rmax分別達(dá)到了145.07 mL/(g·d)和139.32 mL/(g·d)，而λ縮短到0.27 d和0.26 d。模型的參數(shù)也體現(xiàn)出ISR為8和ISR為6并沒(méi)有明顯差異，而ISR為6更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于ISR為4和ISR為2時(shí)，修正Gompertz模型只能很好地描述部分厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(R2>0.99)，見(jiàn)表3，其中ISR為4 的第3輪比第2輪的Rmax進(jìn)一步提高，λ進(jìn)一步縮小，分別達(dá)到106.91 mL/(g·d)和0.32 d，表現(xiàn)出與ISR為8和ISR為6時(shí)一致的規(guī)律。

表3 修正Gompertz方程預(yù)測(cè)的榨汁橙渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.3 Model estimation results of OPR by modified Gompertz models

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以夏橙榨汁渣為發(fā)酵原料，接種物經(jīng)過(guò)一輪馴化，厭氧發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表4。ISR為8和6的甲烷累積產(chǎn)率分別為291.0 mL/g和298.5 mL/g，高于ISR為4和2的269.7 mL/g和208.1 mL/g，且ISR為8和6的產(chǎn)氣周期也較ISR為4和ISR為2時(shí)短。這進(jìn)一步驗(yàn)證了以橙榨汁廢渣為原料開(kāi)展厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，宜采用ISR為6并將接種物馴化一輪。

表4 夏橙榨汁渣厭氧發(fā)酵結(jié)果Tab.4 Results of anerobic digestion of XC

3 結(jié)論

(1)ISR為8和6條件下，榨汁橙渣厭氧發(fā)酵可以正常進(jìn)行，甲烷累積產(chǎn)率分別達(dá)到320.0 mL/g和304.9 mL/g，產(chǎn)氣結(jié)束后發(fā)酵系統(tǒng)中細(xì)菌和古菌的群落組成也相似。同時(shí)，通過(guò)馴化優(yōu)化微生物群落組成雖然不能提高甲烷累積產(chǎn)率，但可以有效縮短發(fā)酵周期，其中，ISR為6條件下第3、2、1輪發(fā)酵前4 d產(chǎn)甲烷量占總產(chǎn)量的93.40%、86.72%和38.03%，有效提高了發(fā)酵效率。開(kāi)展榨汁橙渣中抑制成分在厭氧發(fā)酵中的代謝規(guī)律以及厭氧發(fā)酵的預(yù)處理優(yōu)化等相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，推薦選擇ISR為6，并進(jìn)行至少一輪接種物的馴化以避免因接種物數(shù)量和來(lái)源的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)干擾。

(2)ISR為4條件下，接種物中微生物數(shù)量相對(duì)不足，不能充分利用底物，厭氧發(fā)酵效率低于ISR為8和6，累積甲烷產(chǎn)率也只有ISR為8和6的75.8%和79.6%。在該ISR下通過(guò)馴化接種物來(lái)促進(jìn)厭氧發(fā)酵存在偶然性和不確定性，接種物中本身的微生物菌群落組成可能會(huì)更多地影響馴化的效果和質(zhì)量。

(3)ISR為2條件下，接種物中微生物數(shù)量嚴(yán)重不足，厭氧發(fā)酵出現(xiàn)停滯，累積甲烷產(chǎn)率只有ISR為8和ISR為6的34.8%和36.5%，芽孢桿菌綱相對(duì)豐度下降到1.88%，Methanosaeta和Methanospirillum的相對(duì)豐度也分別下降到24.45%和1.71%，影響了甲烷的產(chǎn)生，且通過(guò)馴化接種物也無(wú)法改變微生物群落組成失調(diào)的狀況。