ARMS法檢測肺腺癌EGFR基因突變分析

吳海喬

（廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院病理科 福建 廈門 361001）

一直以來，尋找早期篩查肺癌的方法是學(xué)者目前的熱門研究問題。表皮生長因子（EGFR）是一種受體型酪氨酸激酶，在細(xì)胞的生長、生殖以及分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。經(jīng)過諸多研究發(fā)現(xiàn)EGFR在多種腫瘤中會存在突變表達(dá)，對腫瘤的生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。尤其是在肺腺癌中具有較高的突變率[2]。臨床實(shí)踐研究中，分析肺腺癌患者的EGFR基因突變對于患者的靶向治療療效具有全面性評價，評價EGFR基因突變檢測，對于選擇合適的患者進(jìn)行靶向治療十分必要。本文則探討采用ARMS法檢測肺腺癌患者的EGFR基因突變并分析。

1.臨床資料

收集我院病理科的148例肺腺癌患者標(biāo)本作為研究對象，包括82例肺活檢標(biāo)本、24例手術(shù)切除標(biāo)本以及42例胸腔積液細(xì)胞塊標(biāo)本。所選患者中男性86例，女性62例，年齡在34-78歲之間，所選患者均未進(jìn)行放化療及其他抗癌治療。

2.研究方法

2.1 標(biāo)本采集與DNA提取

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)切取不同類型的腫瘤標(biāo)本，制作石蠟標(biāo)本，采用廈門艾德公司的石蠟包埋組織樣品 DNA 提取試劑盒，進(jìn)行DNA提取。調(diào)整DNA質(zhì)量濃度至2ng/μl。

2.2 EGFR檢測

檢測EGFR基因突變，具體為19del，L858R以及T790M突變。

采用ARMS法檢測EGFR基因突變，儀器為ABI 7500熒光PCR儀，試劑盒購自廈門艾德生物公司的人類 EGFR 基因突變檢測試劑盒。具體實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行：取上述DNA標(biāo)本23.5μl，加入1.5μlTaq酶，進(jìn)行混勻后取出5μl加入8聯(lián)管。然后進(jìn)行程序擴(kuò)增，95℃ 5min，95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15個循環(huán)；93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，31 個循環(huán)。60℃時收集熒光信號。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1 EGFR基因在肺腺癌標(biāo)本中的突變

本文所選148例肺腺癌患者標(biāo)本，共檢測出EGFR基因突變60例（40.5%）。具體基因突變類型，包括19del突變23例(15.5%)，L858R突變34例(23.0%)，19del和L858R雙突變2例(1.35%)。本文未檢測到T790M突變。

3.2 EGFR 基因突變與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)是否存在EGFR基因突變，進(jìn)行分組為EGFR基因突變陽性組和陰性組，比較不同臨床資料患者間的差異，結(jié)果提示在性別、吸煙史上，EGFR基因突變情況存在差異（P＜0.05）；在年齡及腫瘤家族史上，EGFR基因突變情況不存在差異（P＞0.05）。提示EGFR基因突變與患者的性別及吸煙是存在顯著關(guān)系。

表1 EGFR基因突變與肺腺癌患者相關(guān)因素分析 [n（%）]

4.討論

在NCCN指南推薦中，對于晚期肺腺癌患者的一線治療可根據(jù)是否存在EGFR等驅(qū)動基因事件進(jìn)行指導(dǎo)，其中EGFR基因突變的類型不同，其靶向治療效果亦存在一定的差異。因此，臨床上準(zhǔn)確檢測肺腺癌患者的EGFR基因突變，對于指導(dǎo)患者的個體化靶向治療具有重要意義。EGFR基因突變，與諸多因素有關(guān)，如患者因素、檢測方法以及標(biāo)本因素等。

本文在總結(jié)既往諸多文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，采用以熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的ARMS法，根據(jù)不同位點(diǎn)設(shè)計的特異性探針，特異性識別并擴(kuò)增 EGFR 突變序列，盡量減少非腫瘤組織的干擾。通過ARMS檢測法，最大限度地縮短擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)長度，避免DNA提取出現(xiàn)片段化。結(jié)合RT-PCR平臺在擴(kuò)增時采用了一個閉管操作，簡單，不需要產(chǎn)物的后處理，較大避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，使得結(jié)果更為準(zhǔn)確。

本文研究結(jié)果提示所選148例肺腺癌患者標(biāo)本，共檢測出EGFR基因突變60例（40.5%），檢出率較高，與宿杰·阿克蘇相關(guān)報道一致[1]。進(jìn)一步研究EGFR基因突變的臨床資料，提示不同性別、吸煙史患者其EGFR基因突變發(fā)生率存在差異，女性、不吸煙患者EGFT突變率更高為53.2%、50.5%，提示吸煙會影響患者的EGFR基因突變。而腫瘤家族史以及患者年齡方面因素，不會影響患者的EGFR發(fā)生突變。因此，臨床上對于女性、不吸煙的肺腺癌患者建議進(jìn)行 EGFR基因突變檢測，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。