柑橘多甲氧基黃酮的來源及生物學(xué)作用

張夢(mèng)玲 李綺麗 李高陽(yáng) 付復(fù)華 肖業(yè)成 單 楊 余煥玲

(1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3. 首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院北京市環(huán)境毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；4. 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；5. 漣源康麓生物科技有限公司，湖南 婁底 417000)

據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，2016年全球柑橘產(chǎn)量達(dá)到1.24×108t，但全球的加工量?jī)H為2.35×107t，不足總產(chǎn)量的20%。柑橘皮渣是柑橘加工工業(yè)的副產(chǎn)品，每年全球柑橘皮渣產(chǎn)量達(dá)到4.0×106～5.0×106t，通常未得到充分合理的利用，柑橘皮渣的處理已經(jīng)成為柑橘加工企業(yè)的頭號(hào)難題[2-3]。僅中國(guó)，每年的柑橘皮渣黃酮資源具有1.0×104t，并且黃酮的價(jià)格取決于所開發(fā)產(chǎn)品的品質(zhì)[2]，目前市場(chǎng)上黃酮粗提物的價(jià)格在80～3 000元/kg不等。如果能夠高效地開發(fā)和利用高品質(zhì)的柑橘黃酮，對(duì)有效利用柑橘資源，推動(dòng)柑橘產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程具有重要意義。

PMFs(Polymethoxy flavones)廣泛存在于柑橘屬果皮中，是一類獨(dú)特的多甲基黃酮類化合物。人群、動(dòng)物和細(xì)胞研究的累積證據(jù)[4-12]表明，PMFs具有抗氧化、抗炎、保護(hù)心血管和抗癌等生物學(xué)作用。盡管非多甲氧基黃酮(主要為羥基黃酮)也具有一定的生物學(xué)活性，但研究[13-14]發(fā)現(xiàn)PMFs的生物學(xué)活性是明顯優(yōu)于非多甲氧基黃酮的。含有1%PMFs(主要是橘皮素)的日常飲食喂食35 d可顯著降低雄性敘利亞金黃倉(cāng)鼠的血清總數(shù)和超低密度脂蛋白(VLDL)及低密度脂蛋白(LDL)水平(分別為19%～27%和32%～40%)，降低血清三酰甘油酯的含量。而相同試驗(yàn)條件下，通過喂食3%橘皮苷和柚皮苷(質(zhì)量比1∶1)的混合物，血脂改善程度卻差于1% PMFs的[13]。采用柚皮素、橘皮苷和川陳皮素 (100 μmol/L)分別處理A類清道夫受體介導(dǎo)小鼠 J774A.1巨噬細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)相比未處理的對(duì)照組，黃酮都顯著降低β-VLDL的代謝。其中，川陳皮素的效果最好，降低50%～72%β-VLDL代謝，而柚皮素和橘皮苷下降不足25%[14]。目前普遍認(rèn)為PMFs活性優(yōu)于非多甲氧基黃酮的重要原因之一為多甲氧基增加了黃酮分子的平面型、降低分子極性，有利于生物膜的滲透性，增加細(xì)胞攝取[15-16]。柑橘PMFs作為一種天然物質(zhì)，相比化學(xué)合成藥物，更容易使用和發(fā)揮較少的副作用，從而有助于提高患者的依從性[17]。

基于以上的討論，柑橘PMFs是預(yù)防和治療疾病的一種切實(shí)可行的天然物質(zhì)，其開發(fā)利用對(duì)柑橘行業(yè)的增值增收具有重大意義。因此，本文綜述了柑橘PMFs的來源和其生物學(xué)功效，并對(duì)目前存在的問題進(jìn)行了探討，以期為開發(fā)利用柑橘資源和柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供更好的指導(dǎo)。

1 柑橘多甲氧基黃酮的來源

1934年Nelsont從橘皮精油中提取出橘皮素，1938年Tseng從橙皮中分離出川陳皮素，之后科學(xué)家又從柑橘屬植物中分離出Tetra-O-metrylscutellarein[18]和五甲氧基黃酮[19]。1991年歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)規(guī)定PMFs是苯環(huán)原酮結(jié)構(gòu)上連有4個(gè)或4個(gè)以上的甲氧基黃酮類化合物[20]，結(jié)構(gòu)如圖1所示?，F(xiàn)如今，已報(bào)道的柑橘果皮中蕓香科柑橘屬PMFs多達(dá)40余種，是天然PMFs最主要的來源[13,21]。圖2列出了7種最常見的柑橘PMFs，其中研究的熱門是川陳皮素和橘皮素，是在甜橙和柑橘果皮中含量很高的PMFs[22-23]。

目前關(guān)于PMFs的提取分離與鑒定方法包括醇浸提[24]、超臨界CO2流體萃取[24]、超聲法[24]、離子交換法[25]、高效液相色譜法[26]、超高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器(UPC-DAD)[5]和快速制備色譜[27]等。單楊團(tuán)隊(duì)[2]從溫州蜜橘皮中分離得到4種PMFs單體，并采用波長(zhǎng)掃描光譜、高效液相—質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)和紅外光譜(IR)以及核磁共振(MRI)技術(shù)進(jìn)行精確的結(jié)構(gòu)鑒定，分別為3,5,6,7,8,3＇,4＇-七甲氧基黃酮(Hexamethoxyflavone)、5,6,7,8,4＇-五甲氧基黃酮(Tangeretin)、3-羥基-5,6,7,8,3＇,4＇-六甲氧基黃酮(Natsudaidain)、5,6,7,8,3＇,4＇-六甲氧基黃酮(Nobiletin)，其中3-羥基-5,6,7,8,3＇,4＇-六甲氧基黃酮(Natsudaidain)是首次發(fā)現(xiàn)的。

以廉價(jià)易得的天然產(chǎn)物柚皮苷和橙皮苷為原料，通過糖苷酸性水解、脫氫、溴代、親核取代、D-甲基化、過氧丙酮氧化、D-異戊烯基化和選擇性脫甲氧基等化學(xué)方法半合成一系列的PMFs，包括3-羥基-3＇,4＇,5,6,7,8-六甲氧基黃酮、3-羥基-3＇,5,6,7,8-五甲氧基黃酮、3＇,4＇,3，5,6,7,8-七甲氧基黃酮、3＇,3,5,6,7,8-六甲氧基黃酮、5-羥基-3＇,4＇,3,6,7,8-六甲氧基黃酮、5-羥基-3＇,3,6,7,8-五甲氧基黃酮、5-羥基-3＇,4＇,6,7,8-五甲氧基黃酮、5-羥基-3＇,6,7,8-四甲氧基黃酮[21]。分子克隆技術(shù)也是合成PMFs一種新的手段。以槲皮素為底物，用表達(dá)于大腸桿菌細(xì)胞中的CdFOMT 5進(jìn)行全細(xì)胞生物催化，得到3，3＇，5，7-四甲基化槲皮素[28]。

圖1 多甲氧基黃酮的分子結(jié)構(gòu)Figure 1 Molecular structures of polymethoxyflavone

圖2 常見的柑橘多甲氧基黃酮的分子結(jié)構(gòu)Figure 2 Molecular structures of the common citrus polymethoxyflavone

2 多甲氧基黃酮的生物學(xué)作用

2.1 抗氧化、抗炎與提高免疫力

2.1.1 抗氧化 對(duì)26種PMFs采用2，2-二苯基-1-吡啶酰肼(DPPH)自由基清除活性、鐵還原抗氧化能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)和銅還原抗氧化能力(CUPRAC)4個(gè)理化指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)PMFs具備抗氧化的化學(xué)特性，其中酚羥基是PMFs抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者[5]。

不僅如此，PMFs對(duì)動(dòng)物和細(xì)胞也具有抗氧化特性。脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/GALN)誘導(dǎo)雄性C57BL/6小鼠急性肝損傷模型中，腹腔注射川陳皮素(50，100，200 mg/kg)預(yù)處理2 h可激活NF-κB介導(dǎo)的Nrf 2抗氧化通路，抑制NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而預(yù)防急性肝損傷[29]。主動(dòng)脈束帶(AB)手術(shù)誘導(dǎo)的雄性C57BL/6小鼠心肌肥大模型中，川陳皮素(50 mg/kg、純度>98%)注射可通過抑制NAPDH氧化酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來治療心臟肥大壓力超負(fù)荷[30]。在連續(xù)5 d注射鏈球菌(50 mg/kg)誘導(dǎo)8～10周齡雄性 C57BL 小鼠(體重24～26 g)糖尿病模型中，采用川陳皮素(50 mg/kg、純度>95%)處理11周后，明顯降低NADPH氧化酶的mRNA表達(dá)，即p67phox、p22phox和p91phox，以及減輕氧化應(yīng)激[4]。類似地，在鏈脲佐菌素(50 mg/kg)誘導(dǎo)雄性Wistar大鼠 (體重180～230 g)糖尿病性心血管模型中，10，25 mg/kg川陳皮素處理降低氧化應(yīng)激，減少M(fèi)MP-2和MMP-9水平[7]。在叔丁基過氧化氫(τ-BHP)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的模型中，5～20 μmol/L 橘皮素(純度>95%)預(yù)處理24 h可降低氧化損傷，作用機(jī)制為橘皮素通過MAPK-Nrf2-ARE信號(hào)通路上調(diào)NQO1和HO-1抗氧化酶的活性[31]。這些累積試驗(yàn)說明柑橘PMFs對(duì)生物體具有良好的抗氧化特性，其主要的抗氧化機(jī)制為：① 清除自由基[5]；② 抑制與自由基產(chǎn)生相關(guān)酶的表達(dá)[32-33]；③ 激活抗氧化信號(hào)通路[29]。

2.1.2 抗炎 脂多糖(LPS)誘導(dǎo)、白細(xì)胞介素誘導(dǎo)、膽管結(jié)扎、紫外線B(UVB)輻射誘導(dǎo)是常見的誘導(dǎo)動(dòng)物和/或細(xì)胞炎癥方式。采用鼻內(nèi)滴注的方法在LPS(30 mg/kg)處理之前對(duì)健康的雄性昆明小鼠采用川陳皮素 (5，10，20 mg/kg)預(yù)處理12 h，發(fā)現(xiàn)川陳皮素的治療顯著地降低了LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞數(shù)、TNF-α、IL-6和NO的表達(dá)，從而降低LPS所致的小鼠急性肺損傷(ALI)[8]。柑橘皮提取物(CAE) (50，200 mg/kg CAE中分別含13.50，54.00 mg/kg 川陳皮素)處理膽管結(jié)扎雄性ICR小鼠(5～6周齡)，4周后明顯降低血漿中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、AMPK等促炎細(xì)胞因子的活性，說明CAE對(duì)膽汁淤積癥具有抗炎作用[34]。這2個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)分別說明川陳皮素對(duì)動(dòng)物炎癥具有預(yù)防和治療作用，不足之處在于后者采用的是柑橘皮粗提物，無法排除柑橘皮中其他非PMFs組分的影響。

大量研究也支持PMFs對(duì)細(xì)胞炎癥的預(yù)防和治療作用。對(duì)于LPS (10 mg/mL，20 h)刺激人類胚胎膜和子宮肌層的炎癥感染，200 μmol/L川陳皮素預(yù)處理胎膜和子宮內(nèi)膜1 h后可降低促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6 及 IL-8)、MMP-9的表達(dá)和促M(fèi)MP-9的分泌，川陳皮素還能降低自發(fā)性早產(chǎn)后婦女胎膜中產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子和MMP-9的表達(dá)和產(chǎn)生[35]。LPS(100 ng/mL 20 h)誘導(dǎo)的BV2微膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥的同時(shí)，加入川陳皮素40 μmol/L (HPLC級(jí))或橘皮素60 μmol/L (HPLC級(jí))，發(fā)現(xiàn)川陳皮素和橘皮素都顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥。其中，只有川陳皮素對(duì)LPS誘發(fā)的促炎因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌具有大于50%的抑制能力[36]。30 μmol/L 川陳皮素(純度>98%)在LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞炎癥中具有抗炎作用，作用機(jī)理為降低iNOS和COX-2蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(HO-1)蛋白表達(dá)[37]。川陳皮素 (4，8，16，32，64 μmol/L) 干擾了LPS (5 mg/mL)誘導(dǎo)小鼠J774A.1 巨噬細(xì)胞中PGE2的產(chǎn)生，以及促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)，包括IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6[38]。

川陳皮素 (4，8，16，32，64 μmol/L)以劑量依賴性的方式抑制了人滑膜細(xì)胞rhIL-1α(1 ng/mL)誘導(dǎo)PGE2的產(chǎn)生，川陳皮素選擇性地降低COX-2，但不是COX-1 mRNA的表達(dá)[38]。川陳皮素(純度>95%)與白細(xì)胞介素-1β(1 nmol/L)共處理原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞，可抑制IL-1β單獨(dú)處理時(shí)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(INOS)在肝細(xì)胞中合成炎癥介質(zhì)一氧化氮(NO)，川陳皮素的半抑制NO產(chǎn)生的濃度為(IC50) 51 μmol/L，具有抗炎的作用[39]。川陳皮素的抗炎作用與諸如地塞米松等抗炎類固醇非常相似，川陳皮素獨(dú)特的地方在于其上調(diào)了TIMP-1的表達(dá)，支持了川陳皮素可能是一種新的免疫調(diào)節(jié)和抗炎藥的候選對(duì)象[40]。

暴露于紫外線B(UVB)輻射會(huì)引發(fā)急性皮膚炎癥，如紅斑(曬傷)和水腫。川陳皮素(64 μmol/L)抑制UVB(60 mJ/cm2)誘導(dǎo)人表皮角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)前列腺素E2，不僅抑制了COX-2的表達(dá)，還通過減少人類角化細(xì)胞中cPLA2的活動(dòng)，并抑制小鼠表皮角質(zhì)形成[40]，提示川陳皮素可能作為一種新型的防曬劑，用于預(yù)防光炎癥和光老化。

2.1.3 提高免疫力 口服川陳皮素(50 mg/kg)可抑制5周齡雌性ALB/c 小鼠被動(dòng)皮膚過敏模型的血管通透性，通過抑制磷酸肌醇3-激酶的活化，發(fā)揮抗過敏作用[41]。川陳皮素 (5，10，25 mg/kg溶于 2%氫化蓖麻油)或TAN (5，10，25 mg/kg溶于 2%氫化蓖麻油)都能顯著抑制組胺 (300 μg/50 μL) 或化合物48/80(50 μg/50 μL)引起的雄性ICR小鼠(5周齡、體重20～25 g)和雄性Hartley豚鼠(體重270～330 g)的搔癢行為，同時(shí)抑制組胺誘導(dǎo)的血管通透性。川陳皮素或橘皮素抑制組織胺刺激的皮膚組織中變應(yīng)性細(xì)胞因子IL-4和TNF-α的表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1和p38的激活[42]。對(duì)于抗CD3/CD28抗體刺激雌性 BALB/c小鼠，3, 5, 6, 7, 8, 3′,4′-庚-羥黃酮(HMF，50 mg/kg)可抑制T細(xì)胞生長(zhǎng)并通過減少的磷酸二酯酶(PDE)活動(dòng)和增加的cAMP濃度從而影響免疫功能[6]。

肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞活化是由抗原與IgE結(jié)合到肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和力IgE受體(FceRI)上的一個(gè)強(qiáng)有力的刺激，是引起I型過敏癥的重要原因之一。肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞的活化會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)顆粒與血漿膜融合，隨后釋放出各種顆粒狀的介質(zhì)[41]。在20 μL抗原(DNP，1 μg/mL)誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞(嗜堿性白血病細(xì)胞系)脫顆粒的模型中，采用川陳皮素(10，25 μmol/L 溶于 0.5% 二甲基亞砜)或橘皮素(10，25 μmol/L 溶于 0.5%二甲基亞砜)預(yù)處理可顯著抑制蛋白激酶C(PKC)活性，抑制細(xì)胞脫顆粒[42]。川陳皮素(50 μmol/L)抑制抗原刺激誘導(dǎo)、鈣離子載體A 23187和毒胡蘿卜內(nèi)酯(Ca2+依賴性ATP酶的特異性抑制劑)刺激的RBL-2H3細(xì)胞和骨髓源肥大細(xì)胞脫顆粒。RBL-2H3細(xì)胞被抗原或A 23187刺激時(shí)，川陳皮素也能抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，從而以類似于渥曼青霉素的方式發(fā)揮抗變態(tài)反應(yīng)活性[41]。

2.2 治療在心血管疾病中的作用

流行病學(xué)研究[43-44]表明，經(jīng)常攝入富含類黃酮的食物可降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。飲食中的PMFs已經(jīng)被證明可以抑制血小板功能，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，維持血管完整性這可能是降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)[45-46]。

2.2.1 抑制血小板功能 血小板活化是在各種配體分子與它們的同源細(xì)胞表面受體結(jié)合后啟動(dòng)的，這些受體觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致形狀改變、顆粒含量釋放、血栓素A2(TXA 2)合成和釋放以及血栓形成。但是，一些現(xiàn)有抗血栓藥物(如阿司匹林和氯吡格雷)受到相關(guān)副作用的阻礙，包括嚴(yán)重出血。川陳皮素(12.5～100.0 μmol/L)可延長(zhǎng)C57BL/6小鼠剪尾出血時(shí)間，降低蛋白激酶B(Akt)和γ2在膠原受體(糖蛋白VI)刺激途徑中的磷酸化，提高cGMP水平和血管擴(kuò)張劑刺激的磷酸化蛋白(一種與抑制性環(huán)核苷酸信號(hào)有關(guān)的蛋白)的磷酸化而抑制血小板功能[45]，有望成為一種更安全、更有效和有針對(duì)性的預(yù)防血栓形成的藥物。

2.2.2 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝 對(duì)于與胰島素抵抗(IR)相關(guān)的果糖引起雄性金色敘利亞倉(cāng)鼠高甘油三酯血癥和其他代謝異常，PMF-L或PMF-H[62.5，125.0 mg/(kg·d)，41% PMFs主要為橘皮素和川陳皮素，質(zhì)量比1∶1]灌胃4周能改善高甘油三酯血癥，通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子和過氧化物酶體增長(zhǎng)因子活化受體PPARα和PPARγ的活性而發(fā)揮作用[47]。

PMFs的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用也在細(xì)胞研究中得到了支持。通過巨噬細(xì)胞的清道夫受體(SRs)，如外源凝集素-LDL受體1(LOX-1)，不受控制地?cái)z取氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。川陳皮素抑制THP-1人單核細(xì)胞中清道夫受體基因，降低SR-A、SR-PSOX、CD36和CD68，而不是CLA-1的mRNA表達(dá)，導(dǎo)致了對(duì)DiI-acLDL的封鎖，是一種調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的植物化學(xué)物質(zhì)[48]。橘皮素和川陳皮素可以顯著抑制HepG2細(xì)胞apoB 分泌(IC50分別為13，29 μmol/L)，中度抑制CH合成(IC50分別為 49，68 μmol/L) 和TG 合成(IC50分別為14，73 μmol/L)，而沒有影響LDL-受體的活性。而其他PMFs (例如甜橙黃酮)和非多甲氧基黃酮 (例如橘皮苷和柚皮素)只是微弱地影響了CH 和TG 合成以及apoB分泌(IC50>100 μmol/L)。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)活性分析表明，黃酮類結(jié)構(gòu)的全甲氧基環(huán)與肝apoB分泌的有效抑制活性有關(guān)[49]。

5-去甲基川陳皮素(5～20 μmol/L)顯著減少佛波醇12-十四烷酸13-醋酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)和CD36、清道夫受體α和外源凝集素型氧化LDL受體-1的活性。抑制作用在一定程度上與抑制蛋白激酶C活性和c-Jun NH2-端激酶1/2磷酸化有關(guān)，從而抑制了激活蛋白1和NF-κB的激活[50]。并且，在HepG2人類肝癌細(xì)胞株中，5-去甲基川陳皮素通過類固醇-反應(yīng)元素-結(jié)合蛋白-2激活，顯著地誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體活性和轉(zhuǎn)錄[50]。5-去甲基川陳皮素(5～20 μmol/L)具有不同的抗動(dòng)脈粥樣化生物活性，在抑制單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞分化和泡沫細(xì)胞形成方面比川陳皮素更有效[50]。提示PMFs的代謝產(chǎn)物比PMFs本體具有更優(yōu)良的生物學(xué)特性，但目前關(guān)于PMFs的代謝產(chǎn)物其生物學(xué)作用的報(bào)道并不多，這是未來學(xué)者值得探究的。

PMFs除了直接的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝以外，還可以間接地通過調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、細(xì)胞分化而影響脂質(zhì)代謝。采用HFD (D12492)誘導(dǎo)6周大的雄性老鼠的肥胖模型，在試驗(yàn)期間同時(shí)喂養(yǎng)川陳皮素 (200 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)川陳皮素以視黃酸受體相關(guān)的孤兒受體作為直接靶點(diǎn)，以時(shí)鐘基因依賴的方式強(qiáng)烈對(duì)抗肥胖小鼠代謝綜合征，增加能量消耗和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)[51]。川陳皮素(50 μmol/L)短時(shí)間(15，60 min)處理可增加PER 2：Luc熒光素酶小鼠胚胎成纖維細(xì)胞晝夜節(jié)律幅值，延長(zhǎng)周期，延緩PER 2：Luc晝夜節(jié)律，說明川陳皮素對(duì)晝夜節(jié)律紊亂和時(shí)差有益的影響[52]。

川陳皮素 (128 μmol/L)或橘皮素(128 μmol/L)處理2 d，可將3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量較低的脂肪細(xì)胞。2種類黃酮均能促進(jìn)胰島素增敏因子脂聯(lián)素的分泌，但同時(shí)降低3T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素抵抗因子MCP-1的分泌[53]。川陳皮素(10～100 μmol/L，6 h或24 h)通過激活cAMP/CREB介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)，促進(jìn)T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化和脂解，且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的依賴性[54]。川陳皮素(10 μmol/L，11 d)可誘導(dǎo)ST-13前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，促進(jìn)脂聯(lián)素蛋白的產(chǎn)生[55]。

2.2.3 維持血管完成性 川陳皮素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，在短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(τ-MCAO) 8周齡雄性Wistar大鼠(體重180～220 g)再灌注后于0，1 h分別注射川陳皮素(15 mg/kg) 2次。腦缺血再灌注可引起大鼠腦缺血半球明顯的腦損傷，而川陳皮素治療可明顯減少腦梗死體積，抑制腦水腫, 機(jī)制為川陳皮素治療可明顯抑制中性粒細(xì)胞向缺血區(qū)的浸潤(rùn)，顯著降低缺血半球腦細(xì)胞凋亡，說明抗炎和抗凋亡作用可能是川陳皮素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[56]。

川陳皮素(100 μmol/L)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管原代平滑肌細(xì)胞(VSMCs)(VSMCs是從新生牛的胸主動(dòng)脈獲得)增殖有抑制作用，部分原因在于其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣依賴性JNK活性的抑制作用，川陳皮素對(duì)JNK的抑制意味著它在治療與VSMCs生長(zhǎng)有關(guān)的心血管疾病方面很有用[57]。

2.3 治療在癌癥中的作用

2.3.1 動(dòng)物 川陳皮素對(duì)氮氧甲烷(AOM)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌發(fā)生具有抑制作用。雄性F344大鼠皮下注射AOM(15 mg/kg)，每周1次，連續(xù)3周誘導(dǎo)結(jié)腸異常隱窩(ACF)，大鼠接受含0.01%或0.05%川陳皮素的試驗(yàn)飲食，為期5周，從第一次服用AOM前一周開始。在研究結(jié)束時(shí)(第5周)，發(fā)現(xiàn)川陳皮素抑制AOM誘導(dǎo)ACF，作用機(jī)制為川陳皮素能抑制體外PGE2產(chǎn)生和COX-2蛋白表達(dá)[58]。類似地，5周齡雄性F344大鼠每周皮下注射AOM(20 mg/kg)誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤，然后被給予含0.01%或0.05% 川陳皮素的日糧，為期34周，研究結(jié)束時(shí)，AOM組結(jié)腸腺癌發(fā)生率為67%，0.01% 川陳皮素處理后AOM組結(jié)腸腺癌發(fā)生率為55%，0.05% 川陳皮素處理后AOM組結(jié)腸腺癌發(fā)生率為35%[59]。

抑制血管生成，也稱為血管預(yù)防，是限制實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的一種很有前途的策略[60]。川陳皮素(40 μmol/L、純度>98%)能有效地降低體外人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3和A 2780/CP 70，及無胸腺小鼠模型和雞絨毛尿囊膜(CAM)模型的抗腫瘤活性，其作用機(jī)制為Akt通路抑制卵巢癌的生長(zhǎng)和血管生成[61]。這些文獻(xiàn)都說明PMFs具有抗癌癥的作用。

2.3.2 細(xì)胞

(1) 減少癌細(xì)胞增殖、刺激細(xì)胞凋亡：DU-145和PC-3分別是具有中、高轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細(xì)胞系，川陳皮素(20～80 μmol/L)處理24 h可通過AKT途徑抑制前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和DU-145的細(xì)胞活力[61]。相同劑量下(0～60 μmol/L)，5-去甲基川陳皮素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 和 HT29生長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)于川陳皮素；5-乙?；?6，7，8，4＇-四甲基去橘皮素可誘導(dǎo)MCF-7人胸腺癌細(xì)胞凋亡，而橘皮素沒有這一作用。5-羥基PMFs主要涉及的機(jī)理為影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，p21Cip1/Waf1、CDK-2、CDK-4、phosphor-Rb、Mcl-1、caspases-3、caspases-8和聚ADP核糖聚合酶(PARP)。但不同的5-羥基-PMFs對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的機(jī)制有差異，5-羥基-6,7,8,3＇,4＇-五甲氧基黃酮使HT29細(xì)胞的細(xì)胞周期停留在G2/M期，而5-羥基-3,6,7,8,3＇,4＇-六甲氧基黃酮停留在 G0/G1期[62]。橘皮素(15 μmol/L)和5-去甲基川陳皮素(15 μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，優(yōu)于橘皮素(30 μmol/L)或5-去甲基川陳皮素(30 μmol/L)單獨(dú)處理的，可使人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，通過升高caspase-3活性、降低線粒體膜電位、降低腫瘤壞死因子的生長(zhǎng)抑制活性而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[63]。

(2) 抑制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移：鼻咽癌(NPC)以其頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率而聞名，且預(yù)后不良。川陳皮素(10～40 μmol/L，12～24 h)顯著抑制了HONE-1和NPC-BM細(xì)胞系的遷移/入侵能力，川陳皮素抑制MMP-2的表達(dá)，提高金屬丙二醇對(duì)組織抑制劑的調(diào)節(jié)，降低NF-κB和激活蛋白1(AP-1)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子[64]。川陳皮素(1.0～4.5 μmol/L，24～48 h)抑制了人胃腺癌高轉(zhuǎn)移性AGS細(xì)胞的入侵和遷移，作用機(jī)制為川陳皮素抑制了FAK/PI3K/Akt和小GTPase信號(hào)通路[65]。川陳皮素(10～50 μmol/L，12 h)是一種新的CXCR 4和MMP-9表達(dá)阻斷劑，具有抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移的潛力[66]。對(duì)于神經(jīng)炎癥，川陳皮素(20～100 μmol/L，純度≥97%) 24 h 處理人類U87和Hs683神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞， 抑制有絲分裂蛋白激酶和AKT/蛋白激酶B的途徑，并降低細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，從而導(dǎo)致對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的抑制[65]。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要細(xì)胞過程，在此過程中上皮極化細(xì)胞成為能動(dòng)的間充質(zhì)細(xì)胞[67-68]。川陳皮素(20～120 μmol/L，24 h)通過拮抗TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制人非小A549和H129細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[69]。

(3) 降低癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的耐藥性、提高敏化作用：橘皮素有效地逆轉(zhuǎn)ABCB 1介導(dǎo)的腫瘤對(duì)多種化療藥物的耐藥性，橘皮素與紫杉醇共處理可激活細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，這是因?yàn)殚倨に?2.51～7.53 μmol/L，48 h)能顯著增加A 2780/T細(xì)胞內(nèi)阿霉素和氟替克星-2的積累，減少ABCB 1底物在CaCO2細(xì)胞中的外排，而不改變ABCB 1的表達(dá)，從而降低過表達(dá)的癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥性[70]。橘皮素(25～100 μmol/L，12～24 h)可降低多藥耐藥亞系(lovo/dx)人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，通過抑制P-糖蛋白，羅丹明123蓄積，促進(jìn)阿霉素進(jìn)入細(xì)胞核[23]。與此同時(shí)，橘皮素(25～100 μmol/L，12～24 h)對(duì)耐藥細(xì)胞具有敏化作用。橘皮素對(duì)耐藥細(xì)胞的毒性大于對(duì)敏感癌細(xì)胞的毒性?；熋舾屑?xì)胞株(Lovo)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性也高于多藥耐藥亞系(lovo/dx)[23]。

3 結(jié)論與展望

目前關(guān)于柑橘PMFs生物學(xué)的研究主要集中在細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)上，對(duì)于PMFs的人群研究和流行病學(xué)調(diào)查研究并不多，這是因?yàn)镻MFs主要存在于柑橘果皮中，常規(guī)飲食很難攝取到。那么PMFs優(yōu)良的生物特性能否應(yīng)用于臨床，這需要學(xué)者們將PMFs作為一種補(bǔ)充劑，加入到日常的飲食中，進(jìn)行進(jìn)一步研究。

天然及人工合成的PMFs有很多種，但是目前文獻(xiàn)僅僅大量報(bào)道了川陳皮素和橘皮素的生物學(xué)特性，對(duì)于其他PMFs的研究并不多。一些文獻(xiàn)報(bào)道，羥基形式的PMFs生物學(xué)活性更強(qiáng)[16,21,26,71-73]，但遺憾的是只簡(jiǎn)單討論了其可能的機(jī)制，認(rèn)為這是因?yàn)槎嗔u基進(jìn)一步賦予多甲氧基黃酮分子抗氧化、螯合和氧化活性[74]。PMFs的生物學(xué)活性是優(yōu)于非多甲氧基黃酮的[15-16]，非多甲氧基黃酮多以羥基黃酮為主。為什么羥基化的PMFs比PMFs具有更好的生物學(xué)特性，并未得到充分的解釋。

總之，柑橘果皮富含的PMFs是一種天然的、安全的物質(zhì)?；瘜W(xué)半合成與分子克隆也可作為PMFs來源的補(bǔ)充。多甲氧基黃酮有很大的潛力成為治療人類疾病的有效藥物。