不同方法提取荷花蜂花粉可溶性膳食纖維的多酚含量及對微生物生長的影響

鄭 慧 楊 勇 曾藝瓊 梁倩倩 單 碩 李順祥

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院食品藥品工程系，湖南 長沙 410208；2. 湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208)

蜂花粉被譽(yù)為“微型營養(yǎng)庫”，在中國其藥食兼用歷史可追溯到兩千年前。依托中國豐富的蜂花粉資源，近年來中國蜂花粉相關(guān)研究日益升溫，主要集中在細(xì)胞壁破壁，總黃酮、總多酚、多糖等成分的研究上，其中多酚類組分因其較強(qiáng)的抗氧化性，已成為蜂花粉的特征性功效成分[1-3]。前期研究[4]表明蜂花粉纖維類組分含量豐富，可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)含量為4%～9%。且纖維組分的提取工藝勢必會影響蜂花粉的蛋白致敏源，可能降低蜂花粉致敏性，同時解決含雜含砂、口感獨特等制約其進(jìn)一步開發(fā)利用的難題。

近年來膳食纖維因其良好的生理功能[5-6]，已成為產(chǎn)品開發(fā)的研究熱點，其中SDF因其良好的溶解性，被廣泛地應(yīng)用于乳制品、飲料等食品中[7-8]；同時研究[9-10]多認(rèn)為膳食纖維的抗氧化性、降血糖、減肥、減少慢性胃腸道紊亂等功效與其中含有的多酚類緊密有關(guān)。研究[11]表明蜂花粉中含有豐富的多酚類化合物，則其纖維組分也可能含有一定量的多酚類物質(zhì)。目前，蜂花粉纖維類組分的研究剛剛起步，提取方法對蜂花粉可溶性膳食纖維(bee pollen soluble dietary fiber，BPSDF)中多酚含量影響的相關(guān)研究暫未有報導(dǎo)。本試驗擬在前期研究基礎(chǔ)上，分別采用纖維素酶酶解提取、酸溶液提取、堿溶液提取3種方法制備BPSDF，探究提取方法對BPSDF游離酚、結(jié)合酚及總酚含量，以及對常見致病菌、有益菌生長的影響，為后期蜂花粉纖維組分的深入研究及產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 材料與試劑

荷花蜂花粉：2017年產(chǎn)自湖南，長沙蜂舞人間生物科技有限公司；

原兒茶酸：分析標(biāo)準(zhǔn)品，上海躍騰生物技術(shù)有限公司；

纖維素酶：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

丙酮、福林酚、乙酸乙酯、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、乙醇等：分析純；

LB培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)、SDA培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)白色念珠球菌)、MRS培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌)：杭州百思生物技術(shù)有限公司；

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌：上海魯微科技有限公司；

嗜酸乳桿菌凍干粉：廣東省菌種保藏中心；

雙歧桿菌：由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院食品科學(xué)與工程教研室保存。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱：MJX-150BX型，天津泰斯特儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZM-60KCS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

凈化工作臺：SW-CJ-2FD型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

恒溫振蕩器：ZHWY-200D型，上海智誠分析儀器制造有限公司；

電子分析天平：AV1120型，日本島津儀器有限公司；

電子恒溫水浴鍋：DZKW-4型，北京中關(guān)偉業(yè)儀器有限公司；

pH計：STARTER3100/F型，奧豪斯儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV 2450型，日本島津儀器有限公司；

高效液相色譜儀配紫外檢測器：Agilent 1260型，美國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 BPSDF提取

(1) 纖維素酶酶解提?。簻?zhǔn)確稱取100 g蜂花粉置于pH 4.0水溶液中，加入2.5 g纖維素酶，50 ℃振搖2 h，85 ℃ 水浴10 min滅酶。3 500 r/min離心10 min后取上清液，用4倍體積的95%乙醇醇沉，5 ℃靜置過夜，3 500 r/min 離心10 min 取沉淀，置于真空干燥箱60 ℃干燥10 h得到酶提BPSDF[12]。

(2) 酸溶液提?。簻?zhǔn)確稱取100 g蜂花粉置于pH 4.3水溶液中，50 ℃振搖2 h。3 500 r/min離心10 min取上清液，其后按酶解提取中后續(xù)方法進(jìn)行，得到酸提BPSDF[13]。

(3) 堿溶液提取：準(zhǔn)確稱取100 g蜂花粉置于pH 10.0 水溶液中，50 ℃振搖2 h。3 500 r/min離心10 min取上清液，其后按酶解提取方法進(jìn)行，得到堿提BPSDF[14]。

1.2.2 游離態(tài)多酚的提取 參照Adom等[15]的方法，稍作修改。準(zhǔn)確稱取4.000 g BPSDF于離心管中，加入80%冷凍丙酮溶液16 mL，5 ℃振搖1 h，于3 500 r/min 離心10 min，取上清液。殘渣重復(fù)提取2次，合并上清液，抽濾后45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇定容，-5 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 結(jié)合態(tài)多酚的提取 BPSDF游離酚提取后的殘渣加入2 mol/L NaOH溶液4 mL，充分?jǐn)嚢韬蟊芄庀? h，用濃鹽酸調(diào)至pH 2。加入8 mL乙酸乙酯并充分?jǐn)嚢杼崛?0 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液。重復(fù)提取5 次，合并上清液。抽濾后45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇定容，-5 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 多酚含量的測定 準(zhǔn)確稱取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品，定容后得原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL于10 mL容量瓶中，各加6 mL 水，搖勻，再加0.5 mL福林酚試劑，充分搖勻。1 min 之后，加入20% Na2CO3溶液1.5 mL，混勻后定容。在室溫下反應(yīng)10 min，于765 nm波長下測定吸光值，以原兒茶酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=102.54x+0.005 1 (R2=0.999 2)。BPSDF多酚含量測定的操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。

1.2.5 多酚的HPLC分析 BPSDF多酚提取液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后待用。色譜條件[16]：Ultimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：純水—甲醇(體積比50∶50)；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.6 BPSDF對有益菌、有害菌生長的影響

(1) 菌懸液的制備：供試菌種活化后，挑取斜面培養(yǎng)基上的菌苔，用無菌水采用梯度法稀釋，依次得到不同濃度的供試菌菌懸液。

(2) 試驗培養(yǎng)基的配制：分別稱取BPSDF于適量蒸餾水中，50 ℃振搖5 h，充分溶解后備用。各基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置、密封后，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min，取出后將各BPSDF水溶液按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，得到含有BPSDF分別為 1，3，5 g/L 3個濃度的試驗培養(yǎng)基，同時以不添加BPSDF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照。

(3) 菌體生長試驗、計數(shù)統(tǒng)計：在無菌操作臺上進(jìn)行無菌操作，準(zhǔn)確移入1 mL受試菌菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，再趁熱分別移入10 mL含有BPSDF 1，3，5 g/L 3個濃度的試驗培養(yǎng)基以及對照培養(yǎng)基，振蕩搖勻，待培養(yǎng)基凝固后移入培養(yǎng)箱中，在受試菌規(guī)定的溫度、時間下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同提取方法、不同濃度BPSDF對各受試菌生長的影響。采用平板菌落計數(shù)法，對受試菌的培養(yǎng)結(jié)果按式(1)進(jìn)行活菌落計數(shù)，將結(jié)果換算成lgN進(jìn)行統(tǒng)計分析[17]。

N=n×m×10，

(1)

式中：

N——活菌數(shù)，CFU；

n——細(xì)菌菌落數(shù)，CFU；

m——稀釋倍數(shù)。

1.2.7 統(tǒng)計分析 每個試樣重復(fù)3次。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取BPSDF的游離酚、結(jié)合酚和總酚含量

由表1可得，在提取過程中蜂花粉原料中的多酚類物質(zhì)除溶于水、乙醇溶液而流失外，還有部分被殘留在BPSDF中。多酚在食品基質(zhì)中可能以單體的形式被物理吸附或截留成為游離態(tài)多酚，或與基質(zhì)通過化學(xué)鍵的結(jié)合而成為結(jié)合態(tài)多酚[18]。游離態(tài)多酚多通過胃、小腸消化吸收而發(fā)揮功效；結(jié)合態(tài)多酚則能到達(dá)大腸，在腸道微生物的作用下實現(xiàn)游離化而發(fā)揮其功效[19-20]。

從表1還可知，不同方法提取BPSDF的游離酚、結(jié)合酚和總酚含量均差異顯著，游離酚為0.309～0.435 mg/g，結(jié)合酚含量為0.092～0.135 mg/g，總酚含量為0.444～0.536 mg/g。纖維素酶酶解提取、酸溶液提取、堿溶液提取BPSDF游離酚分別占其總酚的81.16%，80.34%，69.59%，可推知BPSDF中多酚主要以游離酚的形式存在。同時，酶提BPSDF游離酚、總酚含量較高，分別為堿提的1.41，1.21倍；堿提BPSDF結(jié)合酚含量較高，為酸提的1.47倍。不同的提取方法可能導(dǎo)致蜂花粉細(xì)胞壁裂解組分、同一組分裂解方式不同，得到的BPSDF組成成分、分子量大小、碳鏈長短不同[12]，從而影響B(tài)PSDF中殘留多酚的含量及多酚存在形式。

表1 BPSDF游離酚、結(jié)合酚和總酚含量?

Table 1 Contents of free polyphenols, binding polyphenols and total polyphenols in BPSDF mg/g

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同方法提取BPSDF游離酚、結(jié)合酚的HPLC圖譜

3種方法提取BPSDF的游離酚、結(jié)合酚HPLC疊加圖譜如圖1所示，游離酚、結(jié)合酚HPLC圖譜峰形相似，出峰時間相近，出峰面積略有差異。其中，BPSDF游離酚在3.775 min附近均出現(xiàn)較大吸收峰，結(jié)合酚在3.775，4.256 min 附近均出現(xiàn)較大吸收峰。從HPLC圖譜初步推之，提取條件雖對蜂花粉多酚含量有一定影響，但對保留在BPSDF中各游離酚、結(jié)合酚中主要的多酚組分影響較小，其具體差異性還需進(jìn)一步研究確定。

2.3 不同方法提取BPSDF對大腸桿菌生長的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，不同方法提取的BPSDF對大腸桿菌均有一定的抑制作用；且隨著試驗培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，抑制能力增加。同時，同種濃度下添加酶提BPSDF供試培養(yǎng)基的大腸桿菌菌落數(shù)最低，與空白對照組相比在1 g/L濃度下即有極顯著差異，抑制作用最強(qiáng)；其次，酸提BPSDF 1 g/L濃度下與空白對照組相比差異顯著，5 g/L濃度達(dá)到差異極顯著；堿提BPSDF對大腸桿菌的抑制作用相對較低，在5 g/L濃度下與空白對照組相比差異顯著。3種方法提取的BPSDF對大腸桿菌的抑制能力與其含有游離酚、總酚含量高低的趨勢一致。

S1. 酶提BPSDF S2. 酸提BPSDF S3. 堿提BPSDF圖1 BPSDF游離酚、結(jié)合酚HLPC圖譜Figure 1 HPLC chromatograms of free polyphenols,binding polyphenols in BPSDF

*表示與空白對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組差異極顯著(P<0.01)

圖2 BPSDF對大腸桿菌菌落數(shù)的影響

Figure 2 The influence of BPSDF onE.colicolonies

2.4 不同方法提取BPSDF對金黃色葡萄球菌生長的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，3種方法提取的BPSDF對金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用；且隨著試驗培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，抑制能力增加。同時，同種濃度下添加酶提BPSDF供試培養(yǎng)基的金黃色葡萄球菌菌落數(shù)最低，與空白對照組相比在1 g/L濃度下差異顯著，在3 g/L 濃度下達(dá)到差異極顯著，抑制作用最強(qiáng)。其次，堿提BPSDF在3 g/L濃度下與空白對照組相比差異顯著，酸提BPSDF在5 g/L濃度下與空白對照組相比差異顯著。

*表示與空白對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組差異極顯著(P<0.01)

圖3 BPSDF對金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的影響

Figure 3 The influence of BPSDF on Staphylococcus aureus colonies

2.5 不同方法提取BPSDF對白色念珠球菌生長的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，3種方法提取的BPSDF對白色念珠球菌均有一定的抑制作用；隨著試驗培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，抑制能力增加。同時，同種濃度下添加酶提BPSDF供試培養(yǎng)基的白色念珠球菌菌落數(shù)最低，與空白對照組相比在1 g/L濃度下差異顯著，3 g/L 時差異極顯著，抑制作用最強(qiáng)。其次，酸提BPSDF在3 g/L 濃度下與空白對照組相比差異顯著，5 g/L濃度達(dá)到差異極顯著。堿提BPSDF對白色念珠球菌的抑制作用相對較低，在5 g/L濃度下與空白對照組相比差異顯著。3種方法提取的BPSDF對白色念珠球菌的抑制能力與其含有游離酚、總酚含量高低的趨勢一致。

2.6 不同方法提取BPSDF對雙歧桿菌生長的影響

如圖5所示，與空白對照組相比，3種方法提取的BPSDF對雙歧桿菌均有一定的促進(jìn)作用；且隨著試驗培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，促進(jìn)能力增加。同時，同種濃度下添加酶提、酸提BPSDF供試培養(yǎng)基的雙歧桿菌菌落數(shù)較高，與空白對照組相比均在3 g/L濃度下差異顯著，5 g/L 時差異極顯著，促進(jìn)作用較強(qiáng)。堿提BPSDF對雙歧桿菌的促進(jìn)作用相對較低，在5 g/L濃度下與空白對照組相比差異顯著。

*表示與空白對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組差異極顯著(P<0.01)

圖4 BPSDF對白色念珠球菌菌落數(shù)的影響

Figure 4 The influence of BPSDF on Candida sporogenes colonies

*表示與空白對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組差異極顯著(P<0.01)

圖5 BPSDF對雙歧桿菌菌落數(shù)的影響

Figure 5 The influence of BPSDF on Bifidobacterium colonies

2.7 不同方法提取BPSDF對嗜酸乳桿菌生長的影響

如圖6所示，與空白對照組相比，3種方法提取的BPSDF對嗜酸乳桿菌均有一定的促進(jìn)作用；且隨著試驗培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，促進(jìn)能力增加。同時，同種濃度下添加堿提、酸提BPSDF供試培養(yǎng)基的嗜酸乳桿菌菌落數(shù)較高，與空白對照組相比均在1 g/L濃度下達(dá)到差異極顯著，促進(jìn)作用相對較強(qiáng)。相同濃度下酶提BPSDF供試培養(yǎng)基的嗜酸乳桿菌菌落數(shù)較低，在5 g/L濃度下與空白對照組相比差異極顯著，對嗜酸乳桿菌的促進(jìn)作用相對較低。

*表示與空白對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組差異極顯著(P<0.01)

圖6 BPSDF對嗜酸乳桿菌菌落數(shù)的影響

Figure 6 The influence of BPSDF on Lactobacillus acidophilus colonies

3 結(jié)論

本研究探討了3種方法提取的BPSDF中多酚存在形式及其含量，BPSDF對常見有害菌、有益菌的影響。結(jié)果表明，BPSDF中多酚主要以游離酚的形式存在；提取方法對其保留的游離酚、結(jié)合酚的多酚組分影響較小。3種方法提取的BPSDF對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌有較好的抑制作用，對雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌有一定的促進(jìn)作用。從抑制有害菌、促進(jìn)有益菌生長的百分率對比分析，BPSDF對供試有害菌的抑制作用優(yōu)于對供試有益菌的促進(jìn)作用。并且，BPSDF中總酚、游離酚含量與其對供試有害菌抑制作用的趨勢相符，采用纖維素酶酶解提取BPSDF其總酚、游離酚殘留較高，對3種供試有害菌的抑制作用較好。

另外，糖份作為微生物生長所需的養(yǎng)分。BPSDF對微生物生長的影響不僅與其所含多酚相關(guān)，也應(yīng)與其所含糖相關(guān)。故后續(xù)將對不同方法提取的BPSDF中糖的組成做進(jìn)一步研究。