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    范氏法與王玉萬(wàn)法植物纖維素測(cè)定方法探討

    2019-03-30 02:49:40李朝英鄭路莫世宇
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年3期
    關(guān)鍵詞:范氏洗滌劑硫酸

    李朝英,鄭路,2*,莫世宇

    (1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心,廣西 憑祥 532600; 2.廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站,廣西 憑祥 532600)

    纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一。纖維素含量是評(píng)價(jià)植物細(xì)胞機(jī)械組織發(fā)達(dá)程度及作物抗倒伏、抗病蟲(chóng)害能力的主要依據(jù),還是鑒定糧食、蔬菜及纖維作物產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)。纖維素是自然界最為豐富的可再生資源,在造紙、涂料、聚合物等方面有廣泛應(yīng)用[1-3]。纖維素準(zhǔn)確定量分析方法的建立對(duì)纖維素的開(kāi)發(fā)利用有著重要作用。當(dāng)前,纖維素含量測(cè)定方法主要有NREL法、王玉萬(wàn)法、范氏法。NREL法所用的高效液相色譜儀可對(duì)不同極性或不同比例溶液中的多種成分進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)分析,但儀器昂貴,尚未普及。王玉萬(wàn)法和范氏法以蒽酮比色法或重量法檢測(cè)纖維素含量,檢測(cè)設(shè)備簡(jiǎn)單,適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室[4-5]。其中,蒽酮法的測(cè)定原理是,纖維素為β-葡萄糖殘基組成的多糖,在酸性條件下加熱分解的β-葡萄糖與蒽酮脫水縮合,生成黃色的糠醛衍生物,由其顏色深淺可定量測(cè)定纖維素含量高低。重量法的測(cè)定原理是,將樣品經(jīng)酸性洗滌劑消煮所得酸性洗滌纖維(ADF)加硫酸水解纖維素,抽濾清洗后殘?jiān)cADF的差值即為纖維素含量[6-7]。

    現(xiàn)期研究多以范氏法檢測(cè)飼料等植物纖維素、膳食纖維素含量,但有關(guān)范氏法測(cè)定纖維素含量的影響因素的討論分析尚未見(jiàn)報(bào)道。同時(shí),重量法和蒽酮比色法測(cè)定纖維素含量的比較分析也未見(jiàn)報(bào)道。王玉萬(wàn)法與范氏法在測(cè)定纖維素時(shí),樣品消煮用的洗滌劑、消煮時(shí)間及消煮方式均不同,兩種方法的樣品處理程序?qū)w維素測(cè)定結(jié)果的影響尚不明確。鑒于此,本試驗(yàn)對(duì)范氏法中樣品消煮時(shí)間及硫酸濃度、加硫酸靜置時(shí)間進(jìn)行討論分析,探討影響范氏法測(cè)定纖維素含量的因素,同時(shí)對(duì)比分析范氏法-重量法和范氏法-蒽酮法、王玉萬(wàn)法-重量法和王玉萬(wàn)法-蒽酮法測(cè)定植物纖維素的含量,以期為實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確測(cè)定植物纖維素含量,科學(xué)選擇適宜的測(cè)定方法提供可行的參考指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑及儀器

    硫酸,丙酮,十六烷三甲基溴化銨,酸性洗滌劑(20 g十六烷三甲基溴化銨溶于1 000 mL的0.5 mol·L-1硫酸中),十氫化萘,丙酮,蒽酮,葡萄糖,中性洗滌劑(18.6 g乙二胺四乙酸二鈉和6.8 g硼酸溶于少量水中,加入含有30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚、4.56 g無(wú)水磷酸氫二鈉的溶液,定容至1 000 mL)。以上試劑均為分析純級(jí)別。

    電子分析天平(精確至十萬(wàn)分之一克),石墨加熱板,真空泵,馬弗爐,烘箱,F(xiàn)ibertec8000纖維素分析儀。

    1.2 樣品采集與處理

    2017年4月于廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站在熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心伏波實(shí)驗(yàn)場(chǎng)采集馬尾松(Pinusmassoniana)人工林內(nèi)的馬尾松側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱馬枝)、2年生桉樹(shù)(Eucalyptusrobusta)人工林內(nèi)的桉樹(shù)側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱桉枝)、佛肚竹(Bambusaventricosa)側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱竹枝),以及林緣生長(zhǎng)的鬼針草(Bidenspilosa)全株(以下簡(jiǎn)稱草株)。植物樣品在干燥箱中65 ℃烘干后粉碎,過(guò)18目篩(粒徑≤1 mm),裝袋保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 測(cè)定方法

    1.3.1 范氏法-重量法

    稱取樣品0.250 0 g,加入25 mL酸性洗滌劑,加5滴十氫化萘,瓶口加漏斗,保持小沸一定時(shí)間,趁熱倒入已知質(zhì)量的G2玻璃坩堝抽濾,并用熱水沖洗殘?jiān)翞V液無(wú)泡沫且呈中性。用丙酮沖洗殘?jiān)翞V液呈無(wú)色,抽凈丙酮并烘干稱重。倒入3 mL的72%硫酸,如硫酸滲濾下去則及時(shí)補(bǔ)加,室溫放置3 h后用熱水沖洗到中性,收集濾液,并定容到200 mL。殘?jiān)?05 ℃烘箱中烘干稱重,計(jì)算含量。

    按上述方法進(jìn)行操作,將消煮時(shí)間分別設(shè)置為1.0、1.5、2.0 h,或?qū)⒘蛩釢舛确謩e設(shè)置為68%、70%、72%、75%,進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

    1.3.2 王玉萬(wàn)法-重量法

    稱取樣品0.500 0 g,加入50 mL中性洗滌劑,在100 ℃高壓鍋中保溫1 h,以2號(hào)砂芯漏斗過(guò)濾至濾液呈中性,殘?jiān)帽磧纱?。殘?jiān)D(zhuǎn)移到50 mL比色管中,加入50 mL的2 mol·L-1鹽酸溶液,100 ℃高壓鍋保溫50 min,以G2砂芯坩堝過(guò)濾至濾渣呈中性,用丙酮洗2次,加入72%硫酸5 mL,常溫水解3 h,加水45 mL,室溫過(guò)夜。之后烘干、稱重、灰化操作同1.3.1節(jié)。

    1.3.3 范氏法-蒽酮法

    將1.3.1節(jié)收集的濾液抽取1 mL,稀釋至10 mL。抽取1 mL,加入4 mL蒽酮試劑,沸水浴10 min,冷卻后于620 nm處測(cè)定。抽取0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL,分別加入1、0.8、0.6、0.4、0.2 mL水,補(bǔ)足1 mL,加4 mL蒽酮試劑,沸水浴10 min,冷卻后于620 nm處測(cè)定,所測(cè)結(jié)果乘以0.9。

    1.3.4 王玉萬(wàn)法-蒽酮法

    將1.3.2節(jié)收集的濾液抽取1 mL,同1.3.3節(jié)重復(fù)操作。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行整理及繪圖,使用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 消煮時(shí)間對(duì)范氏法-重量法測(cè)定的影響

    由圖1可見(jiàn),消煮1 h所測(cè)ADF及纖維素含量偏高,消煮1.5 h所測(cè)ADF及纖維素含量有所下降,與消煮2 h的趨于一致。這是因?yàn)椋簶悠废? h時(shí),其中的多糖物質(zhì)未被酸性洗滌劑充分溶解,導(dǎo)致所測(cè)ADF中包含了殘留的多糖物質(zhì),加硫酸后,殘留多糖及纖維素水解,故所測(cè)纖維素偏高;樣品消煮1.5~2 h,植物組織中的多糖物質(zhì)溶解充分,加硫酸后,纖維素水解充分,所測(cè)纖維素含量不受多糖干擾,故所測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

    圖1 不同消煮時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

    消煮1 h所測(cè)ADF及纖維素的標(biāo)準(zhǔn)差均>2%,而消煮1.5~2 h所測(cè)ADF及纖維素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均<2%,這說(shuō)明消煮1.5~2 h后,測(cè)定的ADF及纖維素含量離散度較小,誤差較小??梢?jiàn),樣品消煮1.5~2 h有利于纖維素含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

    2.2 硫酸濃度對(duì)范氏法-重量法測(cè)定的影響

    由圖2可見(jiàn),加68%、70%硫酸時(shí)所測(cè)纖維素偏低,加72%、75%硫酸時(shí)所測(cè)纖維素含量結(jié)果較一致。這可能是因?yàn)?8%、70%的硫酸未能充分水解纖維素,72%、75%的硫酸水解纖維素更充分。同時(shí),加68%、70%硫酸所測(cè)纖維素的標(biāo)準(zhǔn)差>2%,而加72%、75%硫酸所測(cè)纖維素的標(biāo)準(zhǔn)差<2%。說(shuō)明用72%、75%硫酸所測(cè)的纖維素含量離散度小,檢測(cè)精密度更優(yōu)。

    圖2 不同濃度硫酸對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

    2.3 不同方法測(cè)定結(jié)果的比較

    由表1可見(jiàn),范氏法-重量法與王玉萬(wàn)法-重量法所測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<4%,而范氏法-蒽酮法與王玉萬(wàn)法-蒽酮法的標(biāo)準(zhǔn)偏差均>4%??梢?jiàn),范氏法-重量法與王玉萬(wàn)法-重量法所測(cè)結(jié)果的精密度優(yōu)于范氏法-蒽酮法與王玉萬(wàn)法-蒽酮法。整體來(lái)看,重量法所測(cè)結(jié)果大于蒽酮法的,尤其是在草株上,重量法的測(cè)定結(jié)果顯著高于蒽酮法。重量法操作簡(jiǎn)單,檢測(cè)誤差易于控制。蒽酮法的待測(cè)液來(lái)自重量法的檢測(cè)系統(tǒng),但后續(xù)操作煩瑣,檢測(cè)干擾多且不易控制,檢測(cè)誤差高于重量法。

    表1 不同方法的測(cè)定結(jié)果對(duì)比 %

    注:同行數(shù)據(jù)后無(wú)相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

    對(duì)范氏法與王玉萬(wàn)法以重量法所測(cè)的纖維素含量作擬合(圖3),2種方法所測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致,相關(guān)性良好。這說(shuō)明王玉萬(wàn)法與范氏法以不同洗滌劑及程序處理樣品,但兩者均能充分溶解植物組織中的多糖,避免殘留在ADF中,不致對(duì)纖維素含量測(cè)定造成干擾。

    圖3 范氏法與王玉萬(wàn)法所測(cè)纖維素含量的相關(guān)性

    3 小結(jié)與討論

    本研究表明,范氏法-重量法測(cè)定纖維素時(shí),樣品適宜的消煮時(shí)間為1.5~2 h,適宜的硫酸濃度為72%~75%。范氏法與王玉萬(wàn)法以重量法所測(cè)纖維素含量結(jié)果趨于一致,精密度良好。重量法操作簡(jiǎn)單,易于控制,精密度高于蒽酮法,是測(cè)定植物纖維素的優(yōu)選方法。

    GB/T 20805—2006和GB/T 2677.8—1994多以稻殼、花生殼類農(nóng)副產(chǎn)品為樣品,消煮1 h后,以72%硫酸水解纖維素。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),適宜消煮時(shí)間長(zhǎng)于1 h。這是因?yàn)楸驹囼?yàn)以喬木為樣品,組織細(xì)胞致密,洗滌劑浸潤(rùn)擴(kuò)散用時(shí)長(zhǎng);而以往研究多以稻殼、花生殼類農(nóng)副產(chǎn)品為樣品,這類樣品的組織細(xì)胞疏松,洗滌劑易于浸潤(rùn)。本試驗(yàn)提出的消煮時(shí)間適用的樣品范圍更廣泛。本試驗(yàn)提出的硫酸濃度范圍較以往研究寬泛,更有利于操作。蒽酮法中,顯色劑配制時(shí)間長(zhǎng)短及加入快慢等都會(huì)影響檢測(cè),且顯色劑專一性差,纖維素水解過(guò)程中木糖也隨之水解,會(huì)干擾檢測(cè)。因此,蒽酮法的檢測(cè)誤差難以避免,且重復(fù)性較重量法欠佳[8-10]。

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