電針對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶與海馬神經(jīng)元NMDA受體表達(dá)的影響

駱雍陽(yáng)　蔣藝燕　楊文丹　趙恩聰　李斐斐　許茜　錢長(zhǎng)暉　董衛(wèi)國(guó)

摘要：目的 觀察電針“百會(huì)”“大椎”“腎俞”對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶與海馬神經(jīng)元NMDA受體NR2A和NR2B表達(dá)的影響，探討電針治療阿爾茨海默病的機(jī)制。方法 6月齡SAMP8小鼠24只，隨機(jī)分為模型組和電針組，同齡正常老化SAMR1小鼠12只為對(duì)照組。電針組電針“百會(huì)”“大椎”“腎俞”30 d。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化染色和Western blot檢測(cè)海馬神經(jīng)元NR2A和NR2B的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.01），原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯縮短（P<0.01），跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P<0.01），海馬神經(jīng)元NR2A相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.01），NR2B相對(duì)表達(dá)量明顯下降（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.01），跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P<0.05），海馬神經(jīng)元NR2A相對(duì)表達(dá)量明顯下降（P<0.05），NR2B相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.01）。結(jié)論 電針能改善SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與電針抑制海馬神經(jīng)元NMDA受體NR2A的表達(dá)和促進(jìn)NMDA受體NR2B的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默?。浑娽?；NMDA受體；SAMP8小鼠

中圖分類號(hào)：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2019）03-0051-05

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture （EA） at acupoints of Baihui （GV20）， Dazhui （GV14） and Shenshu （BL23） on cognitive function and neurons NMDA receptors NR2A and NR2B in the hippocampus in SAMP8 mice； To explore the mechanism of EA in the treatment of Alzheimer disease （AD）. Methods Totally 24 six-month-old SAMP8 mice were randomly divided into model group （n=12） and EA group （n=12）， and the same age SAMR1 mice were as control group （n=12）. The EA group accepted EA at Baihui， Dazhui and Shenshu for 30 days. Morris water maze was used to detect the learning and memory ability of mice. Immunohistochemical staining and Western blot were used to observe the expressions of NR2A and NR2B in hippocampal neurons. Results Compared with the control group， escape latency increased （P<0.01）， the time staying in the quadrant of the platform decreased （P<0.01）， as well as the number passing the original platform （P<0.01）， and the relative expression of NR2A increased （P<0.01） and the relative expression of NR2B （P<0.01） in hippocampus decreased in the model group. Compared with the model group， escape latency decreased （P<0.05）， the time staying in the quadrant of the platform increased （P<0.01）， as well as the number passing the original platform （P<0.05）， and the relative expression of NR2A decreased （P<0.05） and the relative expression of NR2B increased （P<0.01） in hippocampus in EA group. Conclusion EA can improve the learning and memory ability of SAMP8 mice， and its mechanism may be that the EA can inhibit the expression of neurons NMDA receptor NR2A and increase the expression of NR2B in hippocampus.

Keywords： Alzheimer disease； electroacupuncture； NMDA receptor； SAMP8 mice

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其主要病理特征是細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積形成的老年斑、細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元和突觸數(shù)量的減少。有研究報(bào)道，AD早期可見(jiàn)突觸功能障礙和突觸丟失，提高突觸可塑性能改善認(rèn)知功能障礙[1-2]。N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）是一種離子通道型谷氨酸受體，在突觸可塑性的調(diào)控中起非常重要的作用，參與學(xué)習(xí)和記憶的產(chǎn)生和維持過(guò)程[3] 。這與NMDA受體的功能單位N-甲基-D-天冬氨酸受體2A（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2A，NR2A）亞基和N-甲基-D-天冬氨酸受體2B（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B，NR2B）亞基密切相關(guān)。我們前期研究表明，電針治療能改善快速老化模型小鼠亞系SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和突觸功能[4-6]。SAMP8小鼠目前被認(rèn)為是一種較為完善的AD模型[7] ，已廣泛應(yīng)用于AD的研究[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電針SAMP8小鼠“百會(huì)”“大椎”“腎俞”，觀察電針對(duì)SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體NR2A和NR2B表達(dá)的影響，探討電針改善SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制，為電針?lè)乐蜛D的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

6月齡抗快速老化小鼠亞系SAMR1小鼠12只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（京）2011-0012，設(shè)為對(duì)照組；6月齡SAMP8小鼠24只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組和電針組，每組12只，北京維華阜康生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1個(gè)月，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在完全一致的生活環(huán)境和飲食條件下飼養(yǎng)，溫度（23±1）℃，相對(duì)濕度（55±15）%，12 h光照，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按國(guó)際動(dòng)物保護(hù)及使用指南進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

兔多克隆抗體NR2A（批號(hào)ab203197），Abcam；兔多克隆抗體NR2B（批號(hào)21920-1-AP），Proteintech；β-actin（批號(hào)20536-1-AP），Proteintech；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、DAB試劑盒，福州邁新生物工程有限公司；特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司；Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)。G6805-Ⅰ電針治療儀，青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司；0.25 mm×15 mm華佗牌無(wú)菌針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；Morris水迷宮系統(tǒng)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；電鏡CCD相機(jī)-圖像采集分析系統(tǒng)，德國(guó)Soft-Imaging-System公司。

1.3 干預(yù)

電針組采用自制網(wǎng)兜固定小鼠，選擇“百會(huì)”“大椎”“腎俞”進(jìn)行電針治療，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]取穴、定位：“百會(huì)”位于小鼠頂骨的正中，“大椎”位于背部正中（第7頸椎與第1胸椎間），“腎俞”位于第2腰椎下兩旁。具體操作方法：“百會(huì)”向前斜刺2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“腎俞”稍向內(nèi)斜刺3～4 mm，其中“大椎”“腎俞”加電針，“腎俞”雙側(cè)交替進(jìn)行。進(jìn)針后不進(jìn)行手法刺激，連接電針治療儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強(qiáng)度以引起小鼠后肢肌肉輕微顫動(dòng)而不嘶叫為宜。每日1次，每次20 min，8 d為1個(gè)療程，療程間隔2 d，進(jìn)行下1個(gè)療程，共3個(gè)療程。模型組和對(duì)照組不進(jìn)行電針治療，只進(jìn)行與電針組相同方式、時(shí)間和程度的抓取和固定。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，包括有定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。電針治療結(jié)束后開始進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)。將平臺(tái)置于第三象限，沒(méi)于水下1 cm，每日上、下午各訓(xùn)練4次，將小鼠分別從4個(gè)入水點(diǎn)（各象限池壁中點(diǎn)）面向桶壁放入水中，記錄小鼠爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期，如果90 s內(nèi)未找到平臺(tái)則將其引至平臺(tái)并在平臺(tái)停留10 s，記錄逃避潛伏期為90 s，連續(xù)5 d。第6日撤掉平臺(tái)，進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，將小鼠從第一象限池壁中點(diǎn)放入池中，自由游泳90 s后結(jié)束試驗(yàn)，記錄小鼠在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間和跨越原始次數(shù)。

1.5 免疫組化染色檢測(cè)

水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)束后，每組取6只小鼠，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時(shí)剪開右心耳?？焖僮⑷?7 ℃生理鹽水80 mL，再注入4%多聚甲醛80 mL灌流固定。取全腦修塊后立刻放入4%多聚甲醛內(nèi)，4 ℃固定24～48 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。石蠟切片，厚約4 μm，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，將黏附腦組織載玻片置于檸檬酸修復(fù)液中，微波爐加熱修復(fù)，降至室溫。分別加入NR2A抗體和NR2B抗體，4 ℃濕盒孵育過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫1 h后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG的二抗，DAB顯色，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)海馬CA1區(qū)NR2A及NR2B的圖片進(jìn)行分析，計(jì)算NR2A及NR2B的平均光密度（MOD）。

1.6 Western blot檢測(cè)

每組取6只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，灌注針插入左心室，快速注入37 ℃生理鹽水80 mL，快速斷頭取腦，在冰浴上分離出完整海馬，存放于-80 ℃冰箱，稱左側(cè)海馬濕重，加RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF，超聲勻漿后，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA法測(cè)上清液濃度。蛋白樣品用6%SDS-PAGE于常溫下以30 V、20 min，80 V、30 min，120 V、50 min進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，4 ℃、300 mA將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉在搖床上室溫封閉2 h，加入一抗（兔多克隆抗體NR2A，1∶200；兔多克隆抗體NR2B，1∶1500；抗小鼠β-actin，1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次×10 min；加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000），室溫下?lián)u動(dòng)孵育1 h，TBST洗滌3次×10 min。避光將顯影劑的底物A液和B液以1∶1混合后均勻覆蓋至PVDF膜上，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照、觀察。目的條帶采用 Bio-Rad圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值分析，目的蛋白與β-actin灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，其他指標(biāo)采用方差分析，組間比較采用兩兩比較，方差不齊時(shí)用Dunnett's t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

定位航行實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），見(jiàn)表1。空間探索實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組比較，模型組小鼠原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯縮短（P<0.01），跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.01），跨越原平臺(tái)次數(shù)增多（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠NR2A平均光密度顯著升高（P<0.01），NR2B平均光密度值顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠NR2A平均光密度顯著降低（P<0.01），NR2B平均光密度值顯著升高（P<0.01）。見(jiàn)表3、圖2和圖3。

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠NR2A相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.01），NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠蛋白NR2A相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05），NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.01）。見(jiàn)表4。

3 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“呆證”“健忘”等范疇，其基本病機(jī)為腎衰髓虛，髓減腦消，神機(jī)失用。AD病位在腦，根據(jù)經(jīng)絡(luò)理論，“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”（《難經(jīng)·二十八難》），可見(jiàn)，督脈與腦密切相關(guān)，歷代醫(yī)家素有“病變?cè)谀X，首取督脈”之說(shuō)。因此，從督脈調(diào)治AD越來(lái)越受到重視[10]。百會(huì)位于巔頂，其深處為腦之所在，具有醒腦開竅、安神益智的功效，是調(diào)節(jié)腦功能、治療腦部疾病的要穴。大椎是手足六陽(yáng)經(jīng)的交會(huì)穴，為“諸陽(yáng)之會(huì)”，總督一身之陽(yáng)氣，是升陽(yáng)開竅、健腦調(diào)神的效穴。百會(huì)和大椎屬督脈穴，兩穴結(jié)合可使諸經(jīng)通調(diào)，促進(jìn)經(jīng)氣運(yùn)行，濡養(yǎng)腦髓氣血，促進(jìn)陰陽(yáng)平衡。《醫(yī)學(xué)心悟》認(rèn)為“腎主智，腎虛則智不足，故喜忘其前言”，唐容川《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義》指出：“事物之所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎精。益腎生精，化為髓，而藏之于腦中。”腎藏精生髓，腎俞為腎的背俞穴，腎中精氣匯集于此，具有補(bǔ)益腎氣、調(diào)節(jié)督脈之功；腎經(jīng)與督脈相連，入髓連絡(luò)腦海。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[11]和我們前期研究[5-6，12]，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用“益腎調(diào)督”法，選取“百會(huì)”“大椎”和“腎俞”為治療腧穴。

針灸在防治衰老性疾病中發(fā)揮著巨大優(yōu)勢(shì)，治療AD受到越來(lái)越多的重視與關(guān)注[13]。研究發(fā)現(xiàn)，電針“腎俞”“百會(huì)”能減少海馬Aβ沉積，降低tau蛋白的過(guò)度磷酸化，從而改善AD模型大鼠認(rèn)知損傷；益腎調(diào)督針灸法可能通過(guò)減少或抑制AD大鼠血清內(nèi)Aβ水平，降低大鼠海馬CA1區(qū)淀粉樣前體蛋白的表達(dá)[11] 。這與我們前期的研究[5-6，12]相一致。突觸是神經(jīng)元傳遞信息的主要結(jié)構(gòu)，是學(xué)習(xí)與記憶形成的重要形態(tài)學(xué)和功能學(xué)基礎(chǔ)[14]。研究表明，電針治療明顯增加突觸面積與體積，提高突觸素表達(dá)水平[15]，增加CA1區(qū)神經(jīng)元的突觸數(shù)量，改善突觸超微結(jié)構(gòu)[16]；電針“百會(huì)”“腎俞”能提升AD大鼠海馬CA1區(qū)SYN、PSD-95蛋白水平，促進(jìn)突觸可塑性的增強(qiáng)[17]。改善突觸功能被認(rèn)為是減輕AD認(rèn)知損傷的有效治療方式[18]。

NMDA受體是一種重要的離子型谷氨酸能受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其海馬部位[19]。NMDA受體包括3種亞單位，分別是NR1、NR2（NR2A～NR2D）和NR3（NR3a、NR3b）[20]。NMDA受體在突觸可塑性的調(diào)控中起重要作用，參與學(xué)習(xí)和記憶的產(chǎn)生和維持過(guò)程[21]，這與NMDA受體的功能單位NR2A和NR2B亞基密切相關(guān)。研究表明，NR2A缺失的小鼠快速獲得性空間工作記憶發(fā)生了障礙，而上調(diào)NR2A的表達(dá)能損害空間工作記憶能力；NR2A基因突變小鼠表現(xiàn)為在新環(huán)境中自發(fā)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)和潛在學(xué)習(xí)能力降低[22]。NR2B亞基表達(dá)減少的大鼠表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)記憶能力較正常大鼠下降，而給予上調(diào)NR2B表達(dá)的藥物可增強(qiáng)長(zhǎng)時(shí)程作用，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[23]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化和免疫印記檢測(cè)顯示，電針組NR2A蛋白表達(dá)明顯低于模型組，NR2B蛋白表達(dá)明顯高于模型組。邱文興等[24]發(fā)現(xiàn)，電針治療能提高NR2B mRNA的表達(dá)，改善學(xué)習(xí)記憶能力。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

我們前期研究表明，電針SAMP8小鼠“百會(huì)”“大椎”“腎俞”可提高海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸蛋白的表達(dá)，改善突觸的超微結(jié)構(gòu)[6]。因此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為電針改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能與電針抑制海馬神經(jīng)元NR2A的表達(dá)和促進(jìn)NR2B的表達(dá)相關(guān)。但是本實(shí)驗(yàn)未設(shè)置非穴位組，缺少與非穴位治療的對(duì)比，將在今后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。

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（收稿日期：2018-09-06）

（修回日期：2018-09-30；編輯：華強(qiáng)）