硫酸卡那霉素注射液及滴眼液的質(zhì)量評價

蔣孟虹 裘亞 張楊慧,2 趙敬丹 張含智 秦峰,3 劉浩,*

(1 上海市食品藥品檢驗所，上海 201203；2 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203；3 復旦大學化學系，上海 200433)

卡那霉素(kanamycin)是α-去氧鏈胺衍生物組的氨基糖苷類廣譜抗生素，由日本明治制果藥業(yè)株式會社于1958年首次上市[1-2]，我國于1966年開始投入生產(chǎn)。本品適用于敏感腸桿菌科細菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀菌屬等引起的感染，如肺炎、敗血癥、腹腔感染等，其主要不良反應表現(xiàn)為耳毒性和腎毒性[2-4]。

卡那霉素制劑的原料根據(jù)硫酸鹽數(shù)目不同分為單硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·H2SO4)和硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·nH2SO4)兩種。目前，單硫酸卡那霉素收載于中國藥典2000年版(ChP2000)，硫酸卡那霉素收載于ChP2015，其余各國藥典均收錄至少一種原料[5-10]；ChP2015和美國藥典收載硫酸卡那霉素注射液；硫酸卡那霉素滴眼液僅收載于ChP2015。現(xiàn)行標準對原料與制劑的檢驗方法不統(tǒng)一，缺乏對有關(guān)物質(zhì)全面系統(tǒng)的評價，難以真實反映產(chǎn)品的質(zhì)量。

為加強對國家藥物質(zhì)量的監(jiān)督管理，客觀地評價藥品的質(zhì)量現(xiàn)狀，分析產(chǎn)品的主要質(zhì)量問題，進而明確提高產(chǎn)品質(zhì)量的方向[11-12]。硫酸卡那霉素注射液/滴眼液為2017年國家藥品評價性抽驗品種，共計抽樣112批次(其中注射液102批，滴眼液8批)。注射液生產(chǎn)單位均采用單硫酸卡那霉素為原料，加入抗氧劑、絡合劑等輔料攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值，過濾后灌封。滴眼液生產(chǎn)單位則采用硫酸卡那霉素為原料，加入抗氧劑、防腐劑等輔料攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值，過濾后灌裝。本文依據(jù)現(xiàn)行藥品質(zhì)量標準的檢驗結(jié)果結(jié)合探索性研究，評價國產(chǎn)硫酸卡那霉素注射液/滴眼液的質(zhì)量現(xiàn)狀，對比原研制劑的質(zhì)量，并從安全性和有效性的角度出發(fā)對企業(yè)的生產(chǎn)工藝和現(xiàn)行法定標準提出建議。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀；Vector PCX型柱后衍生化儀；Agilent 1260-6550型四級桿/飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀；Dionex ICS5000型離子色譜儀，配備EGC淋洗液自動發(fā)生器和電導檢測器，ASRS 500(4mm)陰離子抑制器。

1.2 試藥

112批硫酸卡那霉素注射液/滴眼液均為2017年國家評價性抽驗樣品，來自國內(nèi)的9個生產(chǎn)企業(yè)；卡那霉素對照品(批號130556-201502，純度67.9%)、卡那霉素B(批號130548-200501，純度100%)、羥苯甲酯(批號100278-201404，純度100.0%)、羥苯乙酯(批號100847-201604，純度99.9%)、羥苯丙酯(批號100444-201403，純度99.6%)、醋酸氯己定(批號100183-201003，純度96.2%)、苯扎氯銨(批號135051-201401，含n-C12H25為66.04%，含n-C14H29為33.96%)和苯甲酸鈉(批號100433-200301，純度100%)均由中國食品藥品檢定研究院提供；2-脫氧鏈霉胺(批號101838279，純度≥97%)由美國Aldrich公司提供；6-O-(3-氨基-3-脫氧-α-D-葡吡喃糖基)脫氧鏈霉胺(批號D26351，純度95%)由加拿大TRC公司提供；苯甲醇(批號20150906，純度99.0%)由上海凌峰化學試劑有限公司提供；山梨酸(批號：1362218，純度99%)由Fluka提供；三氯叔丁醇(批號20140610，純度98.0%)由國藥集團化學試劑有限公司提供；硫柳汞鈉(批號L990N32，純度98%)由北京百靈威科技有限公司提供；(單)硫酸卡那霉素原料藥和相關(guān)輔料均由各制劑生產(chǎn)企業(yè)提供；原研注射液樣品(日本明治制果藥業(yè)株式會社，批號1103)自購；鄰苯二甲醛、四氫呋喃、甲酸、鄰苯二甲醛、乙腈和甲醇均為色譜純；2-巰基乙醇、硼酸、亞硝酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、硫酸、醋酸鈉、無水硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉、硫代硫酸鈉均為分析純。

2 實驗方法

2.1 法定檢驗方法

根據(jù)各企業(yè)樣品的生產(chǎn)日期，按照ChP2010二部或ChP2015二部進行法定標準檢驗。

2.2 探索性研究方法

在法定檢驗結(jié)果及注射劑、眼用制劑重點關(guān)注項目的基礎上，以完善質(zhì)量標準為中心，并結(jié)合藥品的安全性和有效性等方面，進一步開展雜質(zhì)譜，防腐劑含量，氯離子、硫酸根離子及硫代硫酸根離子含量等項目的探索性研究。

2.2.1 有關(guān)物質(zhì)[2]

(1)有關(guān)物質(zhì)的測定：色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(4.6mm×100mm，3.5μm)；流動相：以pH3.4緩沖液(冰醋酸調(diào)節(jié))[含0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液和0.11mol/L硫酸鈉溶液]：甲醇(95:5, V/V)為流動相A，pH3.4緩沖液：甲醇(60:40, V/V)為流動相B，按表1進行線性梯度洗脫；柱溫35℃；流速1.0mL/min；進樣體積5μL；樣品濃度0.5mg/mL。取0.8g鄰苯二甲醛、2mL 2-硫基乙醇、300mL甲醇和700mL硼酸鹽緩沖液(pH10.4)[含10.8g/L氫氧化鈉溶液和18g/L硼酸溶液]，混勻，用0.45μm濾膜過濾，作為柱后衍生化試液；衍生化反應溫度35℃；衍生化試液流速為0.8mL/min；熒光檢測器，激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為455nm。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 The program of gradient elution

(2)雜質(zhì)鑒定

色譜柱：DionexIonPacTMCG17弱陽離子交換柱(0.4cm×5cm)；柱溫30℃；流速為1.0mL/min；進樣體積5μL；流動相為0.1%甲酸水溶液:0.1%甲酸乙腈溶液(1:1, V/V)；離子源：電噴霧電離源(ESI)，正離子模式掃描；掃描范圍：m/z 50～1700；噴霧電壓：3000V；霧化器溫度：220℃；霧化器流速：19L/min。

2.2.2 滴眼液中防腐劑含量的測定

色譜柱：Waters XBridge C18柱(4.6cm×250mm，5μm)；以0.1%磷酸溶液為流動相A；甲醇為流動相B；四氫呋喃為流動相C；流速1.0mL/min；檢測波長214nm；取原液直接進樣；進樣體積5μL；按表2進行線性梯度洗脫。

2.2.3 滴眼液中氯離子、硫酸根離子及硫代硫酸根離子含量的測定

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 The program of gradient elution

色譜柱：IonPac AS 11-H C型分離柱(250mm×4mm)；IonPac AG11-HC型保護柱(50mm×4mm)；流動相：KOH梯度淋洗液；流速：1.0mL/min；電導檢測器檢測；進樣體積：25μL；樣品濃度：0.5mg/mL；按表3進行線性梯度洗脫

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Linear gradient elution procedure

3 結(jié)果與討論

3.1 法定檢驗方法及結(jié)果

3.1.1 法定檢驗方法及存在問題

通過對比、調(diào)研及實驗發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)行法定藥品標準存在以下問題：(1)標準不統(tǒng)一：注射液的原料單硫酸卡那霉素僅收載于ChP2000，其中卡那霉素B和含量測定方法分別為薄層色譜法和抗生素微生物檢定法，而ChP2015中硫酸卡那霉素標準相應項目的檢測方法均為液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(ELSD)，方法之間的可比性差，需統(tǒng)一標準。(2)檢驗項目缺失：原料藥和制劑的標準均缺少有關(guān)物質(zhì)檢查項，硫酸卡那霉素滴眼液缺乏防腐劑檢查項，無法全面表征產(chǎn)品質(zhì)量。(3)限度制定不合理：硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素B組分的控制限度為不得過4.0%，其原料藥標準中(ChP2000)規(guī)定卡那霉素B的限度為不得過2.0%。由于卡那霉素B組分為發(fā)酵副產(chǎn)物，其含量在制劑過程和貯藏等條件下會下降，其限度不應高于原料藥的控制限度。

3.1.2 法定檢驗結(jié)果及發(fā)現(xiàn)問題

按現(xiàn)行質(zhì)量標準檢驗，104批硫酸卡那霉素注射液檢驗結(jié)果均符合規(guī)定，合格率為100%。8批硫酸卡那霉素滴眼液中2批檢驗結(jié)果不符合規(guī)定，合格率為75%；不合格項目為裝量、滲透壓摩爾濃度、可見異物(表4)。不符合產(chǎn)品集中在個別企業(yè)，提示個別企業(yè)的GMP管理仍存在缺陷。

表4 不合格樣品的詳細信息Tab.4 Results of the unquali fi ed samples

3.2 探索性研究結(jié)果

基于硫酸卡那霉素注射液/滴眼液不合格樣品的原因分析及質(zhì)量標準現(xiàn)狀，對其雜質(zhì)譜，滴眼液中防腐劑含量和氯離子、硫酸根離子及硫代硫酸根離子含量等進行研究，以進一步評價各生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量。

3.2.1 雜質(zhì)譜分析[2]

卡那霉素是由卡那鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵和純化工藝中，生物合成主要有效成分卡那霉素A的同時可能生成卡那霉素B、卡那霉素C、卡那霉素D等發(fā)酵副產(chǎn)物和降解產(chǎn)物[2,13]。現(xiàn)行質(zhì)量標準缺少有關(guān)物質(zhì)檢查方法，而ChP2015僅采用HPLC-ELSD法測定卡那霉素B，該方法對雜質(zhì)的分離能力較差，雜質(zhì)的控制不全面，且ELSD系統(tǒng)流動相需具有揮發(fā)性，使得色譜系統(tǒng)的優(yōu)化受到限制。

在本部分探索性研究中，我們從中國藥典分離系統(tǒng)出發(fā)，對HPLC-ELSD法、HPLC-脈沖安培電化學檢測法和HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法進行對比分析，比較不同色譜系統(tǒng)的雜質(zhì)檢出數(shù)量及分離能力，并對其進行優(yōu)化和改進，最終建立了簡便、快捷的HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法，彌補了采用現(xiàn)行中國藥典卡那霉素B測定方法重現(xiàn)性差、靈敏度低、分離能力弱，不能有效控制副產(chǎn)物和降解雜質(zhì)等問題，供試品溶液的典型色譜圖見圖1。

比較卡那霉素的雜質(zhì)譜有利于評價不同企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量。探索性研究采用新建HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法，通過半制備色譜對樣品和破壞性試驗中的主要雜質(zhì)進行分離和富集(系統(tǒng)適用性圖譜見圖2)，應用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)進行雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推測和來源歸屬(表5)。

圖1 HPLC-ELSD系統(tǒng)(A)與HPLC-柱后衍生化-熒光檢測系統(tǒng)(B)供試品溶液的典型色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of samples in ELSD (A)and post column derivatization systems (B)

圖2 HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法系統(tǒng)適用性典型色譜圖Fig.2 Chromatograms of HPLC-post-column derivatizationfl uorescent detection

采用新建HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法，對國內(nèi)不同來源的原料藥、2個企業(yè)8批滴眼液、7個企業(yè)104批注射液及1批次原研注射液(日本明治制果藥業(yè)株式會社)的有關(guān)物質(zhì)進行測定。對不同來源樣品的分析結(jié)果(表6)顯示，原料藥中雜質(zhì)檢出個數(shù)差別不大，但不同企業(yè)樣品中卡那霉素B(0.6%～1.6%)和雜質(zhì)Ⅲ(0.7%～1.9%)的結(jié)果差異顯著；降解產(chǎn)物雜質(zhì)Ⅳ的最低含量為0.5%，而最高含量可達1.8%。這些雜質(zhì)與發(fā)酵條件和純化工藝有關(guān)，精制有利于提高產(chǎn)品質(zhì)量。建議原料生產(chǎn)廠家對生產(chǎn)工藝參數(shù)進行優(yōu)化，加強控制關(guān)鍵技術(shù)指標，從源頭確保下游產(chǎn)品的質(zhì)量。

表5 雜質(zhì)譜研究中雜質(zhì)的LC-Q-TOF-MS測定數(shù)據(jù)及解析Tab.5 LC-Q-TOF-MS data and proposed chemical structures of impurities

表6 樣品測定結(jié)果Tab.6 Determination results of samples

通過對雜質(zhì)譜的研究發(fā)現(xiàn)，原研注射液中各雜質(zhì)含量和雜質(zhì)總量均遠遠低于國產(chǎn)注射液，國產(chǎn)產(chǎn)品的質(zhì)量顯著低于原研產(chǎn)品；而且國內(nèi)同一個廠家不同批次及不同廠家之間制劑樣品的的雜質(zhì)譜均存在較大差異，特別是卡那霉素B和雜質(zhì)Ⅲ的結(jié)果差異顯著(卡那霉素B在0.8%～2.4%之間、雜質(zhì)Ⅲ在0.8%～2.2%之間)。由于卡那霉素B和雜質(zhì)Ⅲ均為發(fā)酵副產(chǎn)物，并非制劑過程中產(chǎn)生，故提示目前卡那霉素原料藥的生產(chǎn)工藝尚不穩(wěn)定。建議企業(yè)嚴格控制發(fā)酵條件，進一步優(yōu)化分離純化方法，提高產(chǎn)品的批間穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量，降低安全風險。穩(wěn)定性試驗(溫度40℃，相對濕度75%)結(jié)果顯示，溫濕度升高條件下，降解雜質(zhì)Ⅳ和雜質(zhì)Ⅴ以及雜質(zhì)總量增加趨勢明顯，故雜質(zhì)Ⅳ和雜質(zhì)Ⅴ可以作為反映制劑內(nèi)在質(zhì)量的關(guān)鍵指標。

綜上所述，不同廠家雜質(zhì)情況差異較大的主要原因可能是生產(chǎn)工藝、原料來源、貯藏條件等因素，建議生產(chǎn)企業(yè)在我國現(xiàn)有的制劑水平條件下優(yōu)化生產(chǎn)工藝。

3.2.2 防腐劑含量

為了減小多劑量包裝眼用制劑在使用中被污染的風險，通常需要添加防腐劑，而防腐劑長時間大劑量使用可能造成角膜上皮細胞損傷，甚至產(chǎn)生毒性反應，故需考察評價防腐劑的濃度[14-16]。國產(chǎn)硫酸卡那霉素滴眼液的處方中均含有防腐劑，但現(xiàn)行標準未設置防腐劑檢查項，故本研究建立了HPLC法測定滴眼液中常用防腐劑(季銨鹽類、尼泊金酯類、醇類、有機酸類、有機胍類、有機汞類)的高通量測定方法(系統(tǒng)適用性典型色譜圖見圖3)。對涵蓋2個生產(chǎn)企業(yè)抽驗的8批滴眼液進行了防腐劑含量測定。8批硫酸卡那霉素滴眼液檢出的防腐劑種類與產(chǎn)品標簽一致，含量分布在92.5%～104.9%，說明生產(chǎn)企業(yè)對防腐劑投料及工藝控制較為理想。

圖3 防腐劑測定系統(tǒng)適用性溶液的典型色譜圖Fig.3 Typical chromatogram of the system suitability solution for preservatives

3.2.3 滴眼液中氯離子、硫酸根離子及硫代硫酸根離子含量

滲透壓摩爾濃度反映溶液中各種溶質(zhì)對溶液滲透壓貢獻的總和。法定檢驗結(jié)果顯示批號為151201的硫酸卡那霉素滴眼液不符合規(guī)定項目為裝量和滲透壓摩爾濃度。其中，滲透壓摩爾濃度高出上限值的6.6%。為了考察滲透壓偏高的原因，探索性研究建立了測定硫酸卡那霉素滴眼液中Cl-、SO42-和S2O32-的離子色譜法。I企業(yè)批號為151201的樣品中Cl-和SO42-的含量較同來源其他批號樣品略高。結(jié)合該批次樣品裝量和滲透壓摩爾濃度的檢驗結(jié)果，分析原因可能和儲藏過程中包裝材料的密封性不佳，導致水分揮發(fā)。提示生產(chǎn)企業(yè)應采用密閉性良好的包裝材料，保證藥品在儲藏及運輸過程產(chǎn)品的安全性。

4 結(jié)論

本次評價性抽驗采用法定檢驗結(jié)合探索性研究對國產(chǎn)硫酸卡那霉素注射液/滴眼液的法定標準和質(zhì)量現(xiàn)狀進行了分析和評價。

按照法定檢驗標準，本次抽驗樣品合格率為98.2%。不合格項目為裝量、滲透壓摩爾濃度、可見異物，均來自同一生產(chǎn)企業(yè)。其中1批的不合格原因可能與儲藏過程中包裝材料的密封性有關(guān)，建議生產(chǎn)企業(yè)對包裝材料的密封性進行再評價。

通過探索性研究，對產(chǎn)品中的主要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)和來源進行了歸屬，分析不同廠家雜質(zhì)情況差異較大的原因，主要是生產(chǎn)原料來源、工藝和貯藏條件等因素造成，建議原料生產(chǎn)企業(yè)對生產(chǎn)工藝參數(shù)進行優(yōu)化，加強控制關(guān)鍵技術(shù)指標，從源頭控制產(chǎn)品的質(zhì)量；建議制劑生產(chǎn)企業(yè)在我國現(xiàn)有的制劑水平條件下優(yōu)化生產(chǎn)工藝。通過探索性研究還進一步完善了卡那霉素原料藥和制劑的法定質(zhì)量標準：(1)新建有關(guān)物質(zhì)測定方法，彌補了現(xiàn)行卡那霉素B測定方法重現(xiàn)性差、靈敏度低的缺陷以及分離能力弱，不能有效控制副產(chǎn)物和降解雜質(zhì)的問題，填補了各國藥典無有關(guān)物質(zhì)測定儀器分析方法的空白；(2)建議硫酸卡那霉素滴眼液的質(zhì)量標準中增加對有關(guān)物質(zhì)、防腐劑含量的控制；(3)建議新版藥典重新收載單硫酸卡那霉素質(zhì)量標準，對單硫酸卡那霉素和硫酸卡那霉素現(xiàn)行標準進行統(tǒng)一。