采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)理念建立并優(yōu)化丙酸交沙霉素有關(guān)物質(zhì)分析方法

張夏 姚尚辰 胡昌勤

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

丙酸交沙霉素(圖1)是交沙霉素9位丙?；a(chǎn)物，屬于半合成大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，臨床上廣泛用于治療化膿性鏈球菌引起的各類(lèi)感染，也可用于對(duì)青霉素、紅霉素耐藥的葡萄球菌感染。由于交沙霉素發(fā)酵過(guò)程中可能引入多種小組分，其本身含有多個(gè)衍生化位點(diǎn)，衍生化過(guò)程中還可能產(chǎn)生多種的衍生化產(chǎn)物等[1]，因此丙酸交沙霉素組分/雜質(zhì)的種類(lèi)復(fù)雜，各組分/雜質(zhì)的含量差異較大，增加了其有關(guān)物質(zhì)合理控制的難度。按大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的控制理念，開(kāi)發(fā)具有高專(zhuān)屬性的HPLC方法，保證分析方法具有理想的重復(fù)性和粗放性，方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中諸組分/雜質(zhì)的快速定位，仍是方法學(xué)研究的關(guān)鍵[2]。

本文采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)(design of experiment, DoE)的理念建立丙酸交沙霉素HPLC有關(guān)物質(zhì)分析方法。與傳統(tǒng)的 “試錯(cuò)法(trial and error)”或者“單因素變化法(one factor at a time)”相比較，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法應(yīng)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理，通過(guò)合理地安排試驗(yàn)、獲取數(shù)據(jù)、對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)影響分離的諸關(guān)鍵因素(強(qiáng)溶劑保留、流動(dòng)相pH、柱溫等)與溶質(zhì)保留值、分離度的關(guān)系等的充分認(rèn)知[3]，因此特別適用于對(duì)復(fù)雜組成的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素有關(guān)物質(zhì)分析方法的建立與優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試藥

丙酸交沙霉素原料(來(lái)源：日本安斯泰來(lái)制藥公司，批號(hào)：PJTYB036、PJTYB037、PJTYC001)；丙酸交沙霉素標(biāo)準(zhǔn)品(來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130361-200301，含量：85.3%)。

醋酸銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純，批號(hào)：F20100910)，乙腈為色譜純，重蒸水。

1.2 儀器

戴安U3000型液相色譜系統(tǒng)(Thermo Fisher Scienti fi c公司，Waltham，MA)。

1.3 方法

圖1 丙酸交沙霉素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of josamycin propionate

用十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以0.015mol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫。流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為231nm；柱溫為40℃。取丙酸交沙霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加乙腈溶解并稀釋制成約含1mg/mL的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。取20μL注入液相色譜儀。

表1 梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution program

1.4 軟件

試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件為Design Expert(試用版，Stat-Ease公司，Minneapolis，MN)。

2 結(jié)果與討論

2.1 已有方法的比較

采用各國(guó)藥典及文獻(xiàn)丙酸交沙霉素有關(guān)物質(zhì)分析方法(表2～3)分析丙酸交沙霉素樣品，各國(guó)藥典方法的色譜圖見(jiàn)圖2，文獻(xiàn)方法的色譜圖見(jiàn)圖3。從主成分的峰形看，日本藥局方方法及文獻(xiàn)方法略好，但全部方法的分離度均不理想；中國(guó)藥典方法有嚴(yán)重的共流峰現(xiàn)象；且實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)柱壓緩慢升高，可能與流動(dòng)相中有機(jī)相比例過(guò)高[磷酸鹽緩沖液-甲醇(18:82, V/V)]有關(guān)。

對(duì)比各色譜統(tǒng)分離條件與分析結(jié)果可見(jiàn)，采用C18色譜柱、醋酸鹽和乙腈為流動(dòng)相有利于各成分的分離，但無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的試錯(cuò)法等得到理想的分析結(jié)果。因此采用DoE方法，以15mmol醋酸銨溶液-乙腈(30:70)為流動(dòng)相、柱溫40℃、流速1mL/min作為初始條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 DoE設(shè)計(jì)參數(shù)的選擇

DoE設(shè)計(jì)需要首先明確自變量與因變量。通過(guò)初步試驗(yàn)，對(duì)影響丙酸交沙霉素分離結(jié)果關(guān)鍵色譜參數(shù)與指標(biāo)進(jìn)行篩選，選擇對(duì)丙酸交沙霉素分離有顯著影響的色譜參數(shù)為自變量，對(duì)直接與分離結(jié)果相關(guān)的指標(biāo)如難分離物質(zhì)的分離度、色譜峰個(gè)數(shù)等為因變量，進(jìn)行DoE優(yōu)化。

按初始分析條件，選擇10支不同品牌的色譜柱分析丙酸交沙霉素，結(jié)果顯示，Xtimate C18(250mm×4.6mm, 5μm, Acchrom)的總體分離情況最好，以此作為DoE優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中的色譜柱。

表2 丙酸交沙霉素各國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的有關(guān)物質(zhì)方法對(duì)比Tab.2 Comparison of related substance methods in different national pharmacopoeias

表3 丙酸交沙霉素文獻(xiàn)方法對(duì)比Tab.3 Comparison of related substance methods in different literatures

篩選流動(dòng)相中影響分離的關(guān)鍵因素。按初始分析條件，保持洗脫強(qiáng)度不變，改變有機(jī)相類(lèi)型。以流動(dòng)相15mmol醋酸銨溶液-甲醇(35:65, V/V)、15mmol醋酸銨溶液-四氫呋喃(35:65, V/V)分析丙酸交沙霉素樣品，發(fā)現(xiàn)色譜峰峰形不佳，主峰前部抬高，且雜質(zhì)分離較差，說(shuō)明甲醇和四氫呋喃不適合丙酸交沙霉素雜質(zhì)分離。改變流動(dòng)相中乙腈的比例，采用流動(dòng)相15mmol醋酸銨溶液-乙腈(35:65,V/V)、(30:70, V/V)、(25:75, V/V)分析丙酸交沙霉素樣品，結(jié)果顯示乙腈比例對(duì)雜質(zhì)分離的情況影響較大。改變醋酸銨溶液的濃度，分別以3、15和100mmol醋酸銨溶液分析丙酸交沙霉素樣品，結(jié)果顯示緩沖鹽濃度對(duì)雜質(zhì)分離情況影響較大。分別改變流動(dòng)相醋酸銨溶液的pH值(15mmol醋酸銨溶液的pH約為6.8)為pH5.0和pH8.0，分析丙酸交沙霉素樣品，結(jié)果顯示，pH5.0時(shí)峰形前延，而pH8.0時(shí)對(duì)分離影響不大，提示，DoE優(yōu)化中醋酸銨溶液的pH值可不作為重要因素進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 丙酸交沙霉素有關(guān)物質(zhì)各國(guó)藥典方法色譜圖Fig.2 The typical chromatograms of related substance methods in different national pharmacopoeias

圖3 丙酸交沙霉素文獻(xiàn)方法色譜圖Fig.3 The typical chromatograms of related substance methods in different literatures

進(jìn)一步確定其它色譜參數(shù)的影響。以柱溫30、40和50℃分析丙酸交沙霉素樣品，結(jié)果顯示，柱溫對(duì)雜質(zhì)分離情況影響較大。而改變流速，以流速0.8、1.0和1.2mL/min分析丙酸交沙霉素樣品，結(jié)果顯示流速對(duì)分離的影響不大。

基于以上試驗(yàn)，確定DoE設(shè)計(jì)中，選擇流動(dòng)相中的有機(jī)相比例、緩沖鹽濃度和柱溫作為優(yōu)化中的自變量，主峰和主峰前色譜峰的分離度(Rs)、第一區(qū)間雜質(zhì)個(gè)數(shù)(Nimp1)、第二區(qū)間雜質(zhì)個(gè)數(shù)(Nimp2)作為優(yōu)化中的因變量。

2.3 DoE優(yōu)化

采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)(RSM)。運(yùn)用Design Expert軟件得到試驗(yàn)運(yùn)行表，運(yùn)行試驗(yàn)，得到響應(yīng)結(jié)果(表4)；利用響應(yīng)值建模，得到各模型參數(shù)(表5)；對(duì)各模型進(jìn)行方差分析(表6)，Rs模型的R2偏低，方程回歸性稍差；其余模型各參數(shù)良好。各模型的回歸方程見(jiàn)表7。

表4 丙酸交沙霉素試驗(yàn)運(yùn)行表及結(jié)果Tab.4 The run list and results of each run

擾動(dòng)圖可直觀地說(shuō)明因素對(duì)響應(yīng)結(jié)果的影響。圖4a顯示因素B、C對(duì)Rs影響顯著，Rs隨因素B(緩沖鹽濃度)、C(柱溫)的增大而減少。圖4b顯示因素B、C對(duì)Nimp1影響顯著，Nimp1隨因素C增大而增大，隨因素B增大而減少。從圖4c可以看出，因素A(有機(jī)相比例)、B、C對(duì)Nimp2影響顯著，Nimp2隨因素B增大而減少，隨因素A、C增大先增大后減少。

建立因素對(duì)響應(yīng)結(jié)果的響應(yīng)面。由于Rs采用線性模型擬合，因此因素間無(wú)交互作用(圖4d)；因素B、C之間也無(wú)交互作用，但因素B具有二階作用(圖4e)；而因素A、B間具有交互作用(圖4f)。

表5 丙酸交沙霉素模型參數(shù)Tab.5 The model parameters of each response

表6 丙酸交沙霉素方差分析表Tab.6 The analysis of variance table

采用滿意度函數(shù)法，求解丙酸交沙霉素色譜系統(tǒng)的最優(yōu)值，根據(jù)優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)(表8)可得到14個(gè)解(表9)，滿意度響應(yīng)面見(jiàn)圖5。按解1條件分析丙酸交沙霉素，并以預(yù)測(cè)誤差(PE)為指標(biāo)評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)性， Rs、Nimp1、Nimp2的PE值的絕對(duì)值均小于20，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好。據(jù)此確定了丙酸交沙霉素最優(yōu)化色譜系統(tǒng)：流動(dòng)相為15mmol醋酸銨溶液-乙腈(34:66, V/V)、柱溫40℃、流速1.0mL/min、色譜柱為Xtimate C18(250mm×4.6mm, 5μm)，色譜圖見(jiàn)圖6。

表7 丙酸交沙霉素的回歸方程Tab.7 The regression equations of each model

圖4 丙酸交沙霉素響應(yīng)結(jié)果的擾動(dòng)圖和響應(yīng)面Fig.4 The perturbation diagram and response surface of each response

表8 丙酸交沙霉素滿意度函數(shù)法優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)Tab.8 The optimization standards using desirability function method

表9 滿意度函數(shù)法得到的丙酸交沙霉素色譜系統(tǒng)最優(yōu)值Tab.9 The optimal HPLC condition using desirability function method

圖5 丙酸交沙霉素色譜系統(tǒng)的滿意度響應(yīng)Fig.5 The desirability surface of the HPLC system

如采用梯度洗脫的方式，流動(dòng)相A為15mmol醋酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈，在0、24、44、50、51和65min時(shí)，流動(dòng)相B的比例為66%、66%、80%、80%、66%和66%，流速為1.0mL/min，柱溫40℃，還可適當(dāng)減少分析時(shí)間(圖7)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度試驗(yàn)

圖6 丙酸交沙霉素色譜系統(tǒng)典型色譜圖Fig.6 The typical chromatogram of the developed method

圖7 丙酸交沙霉素梯度方法色譜圖Fig.7 The typical chromatogram of the developed method using gradient elution

將精密度試驗(yàn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，以主成分峰面積計(jì)，得到方法的日內(nèi)精密度為0.23%，以A組分峰面積計(jì)，得到方法的日內(nèi)精密度為0.20%，均小于2.0%，表明本試驗(yàn)方法的精密度良好。

2.4.2 線性試驗(yàn)

分別以濃度對(duì)主峰峰面積、A組分峰面積進(jìn)行回歸，丙酸交沙霉素主成分和A組分在0.0004～1.9830mg/mL的濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2均為0.9999)。

2.4.3 檢測(cè)限與定量限

以噪音的3倍為指標(biāo)，得到方法的最低檢測(cè)限為0.59ng；以噪音的10倍為指標(biāo)，得到方法的最低定量限為1.77ng。以丙酸交沙霉素的最低檢測(cè)限計(jì)，0.005%的雜質(zhì)能夠被檢出，滿足試驗(yàn)要求。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

3批丙酸交沙霉素原料含量和有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表10。3批原料的含量和有關(guān)物質(zhì)均符合中國(guó)藥典、進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)和歐洲藥典的限度要求。

表10 丙酸交沙霉素原料含量及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果Tab.10 The determination results of raw materials

3 結(jié)論

針對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素雜質(zhì)譜復(fù)雜的特點(diǎn)，基于試驗(yàn)設(shè)計(jì)理念，采用響應(yīng)曲面法建立了丙酸交沙霉素有關(guān)物質(zhì)分析方法。得到的最佳色譜條件優(yōu)于丙酸交沙霉素各國(guó)藥典及文獻(xiàn)的有關(guān)物質(zhì)方法，并對(duì)影響分離結(jié)果的各因素有了全面的理解。該思路可以為其他大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素有關(guān)物質(zhì)分析方法的建立和優(yōu)化提供借鑒。該色譜條件采用揮發(fā)性緩沖鹽作為流動(dòng)相，也便于后續(xù)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的組分/雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。