低聚果糖對(duì)仿刺參生長及生長免疫因子的影響

趙麗麗，包煥玲，姜永新，劉圣臣，劉佳亮，曹學(xué)彬

( 山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264003 )

低聚果糖又稱蔗果低聚糖或果寡糖，是由1～3個(gè)果糖基通過β(2-1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。作為一種天然活性物質(zhì)，低聚果糖質(zhì)量穩(wěn)定，不易被內(nèi)源酶消化，能夠促進(jìn)腸道雙歧桿菌(Bifidobacterium)的增殖，促進(jìn)鈣吸收，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[1-4]，目前已被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、保健品以及動(dòng)物飼料中，被譽(yù)為抗生素時(shí)代后最具潛力的新一代添加劑—促生物質(zhì)。研究表明，飼料中添加低聚果糖，可顯著提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[5]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)[6]的生長性能，提升銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[7]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[8]的非特異性免疫能力。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)，屬棘皮動(dòng)物門、海參綱，具有較高的食用與藥用價(jià)值，是我國名貴的海珍品之一[9]。近年來，隨著仿刺參需求量的增大，其增養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速。然而，由于對(duì)仿刺參的抗逆性研究不足，在遭遇病害或自然災(zāi)害時(shí)，往往會(huì)造成大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。仿刺參無特異性免疫系統(tǒng)，機(jī)體關(guān)鍵防御機(jī)制受細(xì)胞免疫應(yīng)答和非細(xì)胞的體液應(yīng)答調(diào)節(jié)[10]。已有研究表明，飼料中添加殼寡糖和低聚木糖等寡糖類物質(zhì)可顯著提高仿刺參的生長性能和免疫能力[11-13]。低聚果糖是目前已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)化的寡糖類物質(zhì)，而其在仿刺參配合飼料中應(yīng)用尚未見報(bào)道。筆者以仿刺參為研究對(duì)象，通過在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的低聚果糖，研究其對(duì)仿刺參生長、體成分及機(jī)體生長免疫因子的影響，旨在為仿刺參的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料配方及制作

以藻粉和發(fā)酵豆粕為主要原料，設(shè)計(jì)粗蛋白含量約40%的基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%的菊芋低聚果糖(≥95%，凡秘能特種糖業(yè)有限公司)，并設(shè)對(duì)照組(不添加低聚果糖)，制作6組等氮、等能的試驗(yàn)飼料，飼料配方及基本成分見表1。

各固體原料超微粉碎過200目標(biāo)準(zhǔn)篩，按配比稱量質(zhì)量，逐級(jí)混勻。將飼料和海泥(3∶7)充分混勻，加入適量蒸餾水后，用小型飼料擠壓機(jī)擠壓成條形飼料，稍微晾曬后，置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料配方及基本組成(干基) %

注：a.多維、多礦參見文獻(xiàn)[13].

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)開始前，試驗(yàn)用仿刺參于圓柱形養(yǎng)殖水槽中馴養(yǎng)2周，期間投喂基礎(chǔ)飼料。正式試驗(yàn)開始之前，禁食24 h，挑選體質(zhì)健壯，規(guī)格整齊，初始質(zhì)量約20 g的仿刺參720頭，隨機(jī)分布到18個(gè)藍(lán)色圓柱形水槽中(高80 cm，直徑80 cm)。試驗(yàn)分為6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)30頭仿刺參，每種飼料隨機(jī)投喂3個(gè)水槽。

日投喂1次(17:00)，投喂量為仿刺參初始體質(zhì)量的10%，觀察仿刺參攝食情況，調(diào)整次日投喂量。采用氣石進(jìn)行微充氣，每日采用虹吸法將殘餌、糞便吸出后，換水約50%。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)14周。試驗(yàn)期間水溫15.2～18.4 ℃，鹽度26～29，溶解氧>5 mg/L。試驗(yàn)在弱光環(huán)境中進(jìn)行。

1.3 樣品采集與分析

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食48 h，記錄每桶仿刺參的數(shù)量并稱量質(zhì)量，計(jì)算存活率、質(zhì)量增加率和特定生長率；每桶隨機(jī)取10頭仿刺參，解剖分離體壁和腸道，分別置于-20 ℃保存待測(cè)。剩余仿刺參繼續(xù)投喂2周后，每桶隨機(jī)取5頭，用無菌注射器自背部刺入體腔，吸取體腔液，3000 r/min離心10 min后，吸取上清液，保存于-80 ℃待測(cè)。

成活率/%=n/30×100%

質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

特定生長率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

式中，n為試驗(yàn)?zāi)┓麓虆?shù)量(頭)，m1為試驗(yàn)初仿刺參均質(zhì)量(g)，m2為試驗(yàn)?zāi)┓麓虆⒕|(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)時(shí)間(d)。

飼料及仿刺參樣品中水分用105 ℃烘干至恒定質(zhì)量法測(cè)定(GB/T 6435—2006)，粗蛋白用凱氏定氮法測(cè)定(GB/T 6432—2006)，粗脂肪用索氏抽提法測(cè)定(GB/T 6433—2006)，粗灰分用550 ℃損失質(zhì)量法測(cè)定(GB/T 6438—2007)，氨基酸參照GB/T 14924.10—2008，采用全自動(dòng)氨基酸測(cè)定儀(Hitachi L-8900，日本)測(cè)定，總糖依據(jù)文獻(xiàn)[14]測(cè)定。

腸道4 ℃解凍后，按1∶9(m∶V)加入預(yù)冷的蒸餾水后，冰浴勻漿5 min后，3000 r/min離心10 min，吸取上清液待測(cè)。

體腔液中生長激素、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、一氧化氮合酶及腸道勻漿液中丙酮酸激酶、己糖激酶含量采用ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)測(cè)定，測(cè)定方法及活力單位設(shè)定見說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)(P<0.05)采用Duncan氏檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié) 果

2.1 低聚果糖對(duì)仿刺參生長性能的影響

低聚果糖對(duì)仿刺參生長性能的影響見表2。由表2可知，飼料中添加低聚果糖對(duì)試驗(yàn)仿刺參的成活率無顯著影響(P>0.05)。試驗(yàn)仿刺參的質(zhì)量增加率和特定生長率隨低聚果糖含量的增加呈先升后降的趨勢(shì)，均在0.80%試驗(yàn)組達(dá)到最高值(P<0.05)。

以質(zhì)量增加率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)一元二次回歸分析，體質(zhì)量約20 g的仿刺參配合飼料中低聚果糖的適宜添加量為0.55%(圖1)。

表2 低聚果糖對(duì)仿刺參生長性能的影響

注：同行上標(biāo)英文字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同.

圖1 仿刺參質(zhì)量增加率與飼料低聚果糖含量的曲線回歸分析

低聚果糖對(duì)仿刺參階段性生長的影響見表3。由表3可見，對(duì)照組、0.20%試驗(yàn)組仿刺參前6周生長無顯著差異，顯著低于其他各組，其他各組之間無顯著差異；試驗(yàn)6～10周，0.20%試驗(yàn)組仿刺參質(zhì)量增加顯著高于對(duì)照組，但仍低于其他組；試驗(yàn)10周后，1.00%組仿刺參質(zhì)量增加率下降，12周時(shí)與0.20%試驗(yàn)組無顯著差異，14周時(shí)與對(duì)照組、0.20%組均無顯著差異。

以體質(zhì)量與養(yǎng)殖時(shí)間對(duì)仿刺參生長速率進(jìn)行回歸，仿刺參的生長速率符合一元二次曲線，且隨著低聚果糖添加量的增加，曲率逐漸降低；以△增加質(zhì)量與養(yǎng)殖時(shí)間對(duì)仿刺參生長速率進(jìn)行回歸，對(duì)照組，0.20%～0.60%試驗(yàn)組仿刺參生長速率符合對(duì)數(shù)函數(shù)曲線，0.80%、1.00%試驗(yàn)組仿刺參生長速率符合一元二次曲線，且曲率均為負(fù)值(表4)。

2.2 低聚果糖對(duì)仿刺參體壁成分的影響

低聚果糖對(duì)仿刺參體壁成分的影響見表5。由表5可見，低聚果糖對(duì)仿刺參體壁水分和粗脂肪含量無顯著影響，粗蛋白及粗灰分含量有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，總糖含量隨飼料低聚果糖含量的增加而增加，1.00%試驗(yàn)組比對(duì)照組含量提高了11.58%和29.27%(P<0.05)。

表3 低聚果糖對(duì)仿刺參階段性生長的影響 g

表4 低聚果糖對(duì)仿刺參生長速率的影響

注：ym為每次取樣時(shí)仿刺參的體質(zhì)量，xt為養(yǎng)殖時(shí)間，y△m為每次取樣時(shí)仿刺參的質(zhì)量增加量.

表5 低聚果糖對(duì)仿刺參體壁基本成分的影響 %

注：*粗蛋白、粗脂肪、粗灰分及總糖均為干基含量.

低聚果糖對(duì)仿刺參體壁氨基酸的影響見表6。由表6可見，仿刺參體壁中甘氨酸、半胱氨酸及精氨酸隨低聚果糖含量的增加均呈先升后降的趨勢(shì)，分別在0.60%、0.80%、0.60%組達(dá)到最高，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；谷氨酸含量隨低聚果糖含量的升高呈先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)；飼料添加低聚果糖對(duì)仿刺參體壁其他氨基酸及總氨基酸含量無顯著影響(P>0.05)。

2.3 低聚果糖對(duì)仿刺參生長免疫因子的影響

低聚果糖對(duì)仿刺參生長免疫因子的影響見表7。由表7可見，體腔液中生長激素、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4及一氧化氮合酶含量均隨低聚果糖的升高呈先升后降的趨勢(shì)，但腸道丙酮酸激酶和己糖激酶活力隨低聚果糖的升高而升高(P<0.05)。

表6 低聚果糖對(duì)仿刺參體壁氨基酸含量的影響 %

注：*為必需氨基酸.

表7 低聚果糖對(duì)仿刺參生長免疫因子的影響

3 討 論

3.1 飼料中添加低聚果糖對(duì)仿刺參生長的影響

低聚糖是一種新型功能性糖源，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、飲料、醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域[15]。低聚糖主要分為兩類：一類為普通低聚糖，具有易消化、低甜度、低滲透特性，可延長供能時(shí)間，增強(qiáng)肌體耐力，抗疲勞，如蔗糖、乳糖等；另一類為功能性低聚糖，這類糖進(jìn)入大腸作為雙歧桿菌的增殖因子，能有效地促進(jìn)雙歧桿菌的生長繁殖，抑制腐敗菌生長[16]，如低聚果糖、殼寡糖、低聚木糖等。功能性低聚糖是典型的益生元，其中殼寡糖和低聚木糖已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中，并取得了較好的應(yīng)用效果[17-19]。本試驗(yàn)中，添加低聚果糖顯著提高了仿刺參的生長性能，與窄爪小龍蝦(Astacusleptodactylusleptodactylus)[20]和奧尼羅非魚[21]的研究結(jié)果一致。與殼寡糖和低聚木糖類似[12-13]，低聚果糖促進(jìn)仿刺參生長的機(jī)理與其增殖腸道雙歧桿菌、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、促進(jìn)礦物元素吸收等功能有關(guān)。本試驗(yàn)中，仿刺參的生長與飼料中低聚果糖的含量呈現(xiàn)顯著的劑量反應(yīng)效應(yīng)，當(dāng)?shù)途酃翘砑恿窟^低(≤0.20%)或過高(≥0.80%)時(shí)，仿刺參質(zhì)量增加率均低于中間添加量組(0.20%～0.80%)。從生長速率分析，隨著低聚果糖添加量的增加，仿刺參的生長速率逐漸降低，尤其是0.80%及1.00%試驗(yàn)組的生長速率趨于0甚至是負(fù)值，表明二者后期仿刺參的生長速度低于不添加組。Shiau等[22]報(bào)道了飼料中添加殼寡糖(≥2.00%)會(huì)抑制奧尼羅非魚生長；而黃燕華等[23]研究表明，凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的質(zhì)量增加率與飼料中低聚木糖含量(≤0.05%)呈正相關(guān)。有研究報(bào)道，低聚糖類能吸附金屬離子[24]，與蛋白質(zhì)、脂類等結(jié)合[25]，過量添加會(huì)直接阻礙機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。由此可見，功能性低聚糖類在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用需嚴(yán)格控制添加量。

3.2 飼料中添加低聚果糖對(duì)仿刺參體壁基本成分的影響

本試驗(yàn)中，仿刺參體壁基本成分含量未受低聚果糖含量的影響，但Barbara等[26]研究表明，低聚果糖降低了大西洋鮭(Salmosalar)全魚粗蛋白含量。這可能與養(yǎng)殖動(dòng)物的食性、低聚果糖添加量、養(yǎng)殖時(shí)間等有關(guān)。同時(shí)有研究表明，添加殼寡糖或低聚木糖等功能性低聚糖，對(duì)仿刺參[12]、大菱鲆[27]、奧尼羅非魚[28]的體成分均無顯著影響。本試驗(yàn)中，仿刺參體壁粗灰分含量有升高的趨勢(shì)，與飼料中低聚果糖促進(jìn)鈣的吸收有關(guān)[4]，未達(dá)顯著水平，可能與仿刺參生長環(huán)境中鈣離子含量較為豐富有關(guān)。低聚果糖顯著提高了仿刺參體壁中總糖的含量，與白陽[14]的研究中殼寡糖能提高仿刺參體壁中總糖含量的結(jié)果類似。

本試驗(yàn)中，低聚果糖提高了仿刺參體壁中谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和精氨酸的含量。目前尚無關(guān)于低聚果糖改變機(jī)體氨基酸組成的報(bào)道，但白陽[14]的研究表明，殼寡糖可顯著提高仿刺參體壁中膠原蛋白的含量，而甘氨酸和谷氨酸含量分別占仿刺參膠原蛋白中總氨基酸含量的1/3和1/10[29]，因此本試驗(yàn)中仿刺參體壁中甘氨酸和谷氨酸含量的增加，可能是低聚果糖增加了仿刺參體壁膠原蛋白的含量所致。

3.3 飼料中添加低聚果糖對(duì)仿刺參生長免疫因子的影響

生長激素是機(jī)體內(nèi)最重要的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在代謝和促生長方面發(fā)揮著重要作用[30]，能調(diào)節(jié)水生動(dòng)物的滲透壓[31]。目前在棘皮動(dòng)物中尚未見關(guān)于生長激素的相關(guān)報(bào)道，但Matthew等[32]在仿刺參體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)促甲狀腺激素釋放激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素等激素的前體，預(yù)示著仿刺參體內(nèi)存在著內(nèi)分泌系統(tǒng)。本試驗(yàn)的仿刺參體腔液中生長激素含量與褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)血漿中生長激素含量[31]相差無幾，但仿刺參體腔液處于開放的循環(huán)系統(tǒng)中，其激素的分泌與調(diào)控值得深入研究。

目前已經(jīng)證實(shí)仿刺參體內(nèi)存在補(bǔ)體系統(tǒng)[33]，且補(bǔ)體活力的大小與其疾病抵抗能力密切相關(guān)[34]。本試驗(yàn)中所測(cè)得仿刺參體腔液中補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4含量顯著低于中華鱉(Pelodiscussinensis)[35]和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[36]，這與試驗(yàn)動(dòng)物與測(cè)定方法的不同有關(guān)。仿刺參體腔液中補(bǔ)體C3及補(bǔ)體C4與低聚果糖均存在劑量反應(yīng)效應(yīng)，說明低聚果糖能通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)，提高仿刺參的免疫能力。

一氧化氮合酶是催化L-精氨酸裂解成L-瓜氨酸和一氧化氮的酶，是仿刺參體內(nèi)重要的免疫指標(biāo)之一[14,37]。本試驗(yàn)中，一氧化氮合酶活力隨低聚果糖添加量的增加呈先升后降的趨勢(shì)，說明低聚果糖對(duì)仿刺參的免疫有刺激作用。仿刺參體腔細(xì)胞體外試驗(yàn)表明，褐藻寡糖可提升一氧化氮合酶活力[38]；但低聚果糖可增殖機(jī)體內(nèi)雙歧桿菌，而雙歧桿菌可引起整體免疫應(yīng)答的特異抗原、影響腸道黏膜免疫細(xì)胞群的數(shù)量及分布[39]。因此，不同寡糖類物質(zhì)提高機(jī)體免疫能力的機(jī)理可能存在差異。

丙酮酸激酶和己糖激酶是生物體糖代謝的關(guān)鍵酶，二者活力升高表明機(jī)體糖代謝活躍。本試驗(yàn)中，仿刺參腸道丙酮酸激酶和己糖激酶活力均隨低聚果糖含量的增加而增大，表明低聚果糖的添加促進(jìn)了仿刺參體內(nèi)糖代謝。低聚果糖是由果糖基通過β(2-1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的寡糖，從結(jié)構(gòu)與生理功能分析，其促進(jìn)糖代謝的原因可能有兩方面：(1)仿刺參體內(nèi)存在β(2-1)糖苷鍵水解酶，可直接利用低聚果糖；(2)低聚果糖通過增殖體內(nèi)有益菌群，產(chǎn)生糖類代謝物，促進(jìn)體內(nèi)糖代謝。通常來講，生物體內(nèi)缺乏β(2-1)糖苷鍵水解酶，因此低聚果糖促進(jìn)仿刺參糖代謝的原因更傾向于后者，但目前尚缺乏直接證據(jù)。

4 結(jié) 論

飼料中添加適量的低聚果糖可以促進(jìn)仿刺參生長，提高體壁總糖含量，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。以質(zhì)量增加率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，仿刺參飼料中低聚果糖適宜添加量為0.55%。