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    HPLC法測(cè)定人血漿中伏立康唑及其代謝物的濃度

    2019-03-29 05:29:16王志君楊云云張文靜王學(xué)彬宋洪杰
    藥學(xué)實(shí)踐雜志 2019年3期
    關(guān)鍵詞:罌粟堿伏立康氮氧化物

    王志君,楊云云,張文靜,王學(xué)彬,宋洪杰,王 卓

    (海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部,上海 200433)

    伏立康唑(voriconazole)為三唑類廣譜抗真菌藥,2004年被FDA批準(zhǔn)為曲霉菌或念珠菌血癥的首選藥物。其抑制麥角甾醇的合成,導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性異常,促使真菌細(xì)胞死亡,從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗真菌效應(yīng)[1]。與其他三唑類抗真菌藥相比,伏立康唑是一種耐受性良好的藥物,但有肝毒性、神經(jīng)毒性,同時(shí)伏立康唑的藥動(dòng)學(xué)個(gè)體間差異很大,主要原因是人體內(nèi)的代謝酶CYP2C19具有遺傳多態(tài)性,特別是亞洲人中弱代謝者的發(fā)生率高達(dá)15%~20%,同時(shí)患者自身的疾病狀態(tài)或合并用藥可能增加伏立康唑代謝的差異[2-7]。因此,對(duì)伏立康唑及其主要代謝物伏立康唑氮氧化物進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)具有臨床意義。目前,用于伏立康唑血藥濃度測(cè)定的方法主要包括微生物檢測(cè)法、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11],考慮到臨床應(yīng)用的實(shí)用性和可行性,本研究建立了樣品沉淀蛋白,并用HPLC-UV測(cè)定的方法,使其具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的特點(diǎn),并可以同時(shí)測(cè)定伏立康唑及其氮氧化物,以便用于日常治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)和個(gè)體化給藥調(diào)整。

    1 材料

    1.1 儀器

    LC-20A高效液相色譜儀(包括SPD-20A紫外檢測(cè)器、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱日本島津公司);C18-AR色譜柱(ACE 150 mm×4.6 mm,柱號(hào):V12-6682);XW-80A渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司);離心機(jī)(Eppendorf AG 22331 Hamburg 5452ZR858343);SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);DL-180A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);1.5 ml微型離心管(EP管)。

    1.2 藥品與試劑

    伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品食品檢定研究院,批號(hào):100862-201402,含量 99.2%);罌粟堿(Cayman CHEMICAL 公司,批號(hào):0476735-1,含量≥98%);伏立康唑氮氧化物(Toronto Research Chemicals公司,批號(hào):7-dpm-64-3,含量97%);甲醇、乙腈(色譜純)、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉(分析純,上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司);空白人血漿(長海醫(yī)院血庫)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

    LcSolution版本1.26 SP1(日本島津公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱ACE 5 C18-AR(150 mm×4.6 mm,柱號(hào):V12-6682),以0.025 mol/L磷酸二氫鈉(含三乙胺400 μl/L,用0.25 mol/L的氫氧化鈉調(diào)至pH為7.0)-乙腈(67∶33)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長:255、276 nm(雙波長檢測(cè)),流速:1.0 ml/min,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4 ℃,柱溫:40 ℃,進(jìn)樣量:20 μl。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1對(duì)照品溶液

    精密稱取伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品、伏立康唑氮氧化物標(biāo)準(zhǔn)品適量,置50 ml棕色量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,即得400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,置2~8 ℃冰箱冷藏保存,備用。

    2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液

    精密稱取罌粟堿適量置100 ml棕色量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度,得濃度為100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液;取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液5 ml置100 ml棕色量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,得濃度為5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液,置2~8 ℃冰箱冷藏保存,備用。

    2.3 血漿樣品的預(yù)處理

    取血漿0.3 ml于1.5 ml的EP管中,再加乙腈至1.2 ml,渦旋振蕩0.5 min,13 000 r/min離心15 min,取上清液20 μl進(jìn)樣分析。

    2.4 方法專屬性試驗(yàn)

    分別取空白血漿、加入內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿、加入伏立康唑和伏立康唑氮氧化物及內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿、使用伏立康唑的患者血漿樣品,按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行前處理,按“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)伏立康唑氮氧化物、罌粟堿、伏立康唑保留時(shí)間分別為4.5、11.3、13.7 min,各峰分離度均大于2,理論塔板數(shù)均大于1 000,空白血漿和流動(dòng)相中干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%,并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%,結(jié)果見圖1。

    2.5 線性關(guān)系考察

    取空白血漿及伏立康唑和伏立康唑氮氧化物儲(chǔ)備液以及罌粟堿儲(chǔ)備液,將伏立康唑和伏立康唑氮氧化物濃度分別配制為0.5、1、2、5、10、15、20 μg/m1,內(nèi)標(biāo)罌粟堿濃度調(diào)為3.75 μg/m1的混合血漿樣品。按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以伏立康唑氮氧化物和罌粟堿面積的比值(F1)對(duì)血漿濃度(C1)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重系數(shù):1/C),得回歸方程為:F1=0.111 1 C1+0.020 0,r=0.999 5;以伏立康唑和罌粟堿面積的比值(F2)對(duì)血漿濃度(C2)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重系數(shù):1/C),得回歸方程為:F2=0.070 74C2-0.038 60,r=0.999 5。結(jié)果表明,伏立康唑和伏立康唑氮氧化物在0.5~20.0 μg/m1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。定量限濃度為0.2 μg/ml(S/N>10)。

    2.6 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

    2.6.1批內(nèi)回收率和精密度

    分別配制定量下限及低、中、高濃度樣品(0.5、1、5、15 μg/m1)的質(zhì)控(QC)血漿樣品,每個(gè)濃度取5個(gè)樣本,按“2.3”項(xiàng)方法操作,測(cè)定。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定QC樣品的相對(duì)回收率,伏立康唑:101.3%、103.8%、94.2%、91.7%(RSD分別為6.2%、4.4%、4.7%、1.4%,n=5),伏立康唑氮氧化物:106.8%、100.1%、94.3%、91.6%(RSD分別為6.2%、4.8%、4.7%、2.1%,n=5)。

    2.6.2批間回收率和精密度

    分別配制3批的定量下限及低、中、高濃度樣品(0.5、1、5、15 μg/m1)的QC血漿樣品,每個(gè)濃度取5個(gè)樣本,按“2.3”項(xiàng)方法操作,分3 d進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)的當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算QC樣品的回收率,伏立康唑:97.9%、99.6%、102.6%、101.6%(RSD分別為9.2%、5.9%、3.3%、3.6%),伏立康唑氮氧化物:100.9%、100.0%、97.3%、98.7%(RSD分別為9.3%、6.4%、5.9%、6.7%)。

    圖1 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的專屬性色譜圖 A.空白血漿;B.空白血漿+內(nèi)標(biāo);C.空白血漿+伏立康唑?qū)φ掌?伏立康唑氮氧化物對(duì)照品+內(nèi)標(biāo);D.患者血漿+內(nèi)標(biāo) 1.伏立康唑氮氧化物;2.伏立康唑;3.罌粟堿

    2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    2.7.1工作溶液

    取伏立康唑和伏立康唑氮氧化物乙腈溶液,配成0.5、2.0、15 μg/m1濃度系列,以及罌粟堿乙腈溶液1.0 μg/m1,按“2.1”項(xiàng)下方法處理進(jìn)樣,分別于日內(nèi)和日間進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算日內(nèi)和日間誤差。結(jié)果顯示,伏立康唑日內(nèi)(0、2、4、6、8 h)和日間(3 d)測(cè)得濃度的RSD分別為1.6%和1.2%;伏立康唑氮氧化物日內(nèi)(0、2、4、6、8 h)和日間(3 d)測(cè)得濃度RSD分別為1.5%和2.0%;罌粟堿測(cè)得濃度RSD為1.5%。伏立康唑、罌粟堿和伏立康唑氮氧化物的乙腈溶液3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.7.2血漿樣品

    制備伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低、高濃度(含伏立康唑氮氧化物和罌粟堿)的血漿樣品,分別進(jìn)行:①反復(fù)3次凍融 (-20~25℃)穩(wěn)定性試驗(yàn);②含藥血漿樣品(-20℃)放置1個(gè)月穩(wěn)定性試驗(yàn);③血漿樣品處理后48 h穩(wěn)定性試驗(yàn);④血漿樣品自動(dòng)進(jìn)樣器中(4℃)放置24 h穩(wěn)定性試驗(yàn);⑤樣品常溫放置24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“2.3”項(xiàng)方法操作,每個(gè)濃度取5個(gè)樣本,測(cè)定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)的當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果由表1可見:血漿樣品反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定性良好;血漿樣品在-20℃條件下至少可以保存1個(gè)月;血漿樣品處理后可在室溫下保存48 h;處理后的血漿樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中(4℃)、室溫中至少可保存48 h。

    表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5,%)

    2.8 臨床標(biāo)本測(cè)定應(yīng)用

    取血液科服用伏立康唑(同時(shí)服用環(huán)孢素A)的臨床患者的血液樣品(采用EDTA抗凝管,取血量2~3 m1),3 000 r/min離心5 min,取血漿300 μl,加5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液至1 200 μl,渦旋振蕩0.5 min,13 000 r/min離心15 min,取上清液20 μl進(jìn)樣分析,根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。10例患者中,伏立康唑血藥濃度在0.49~5.2 μg/m1;伏立康唑氮氧化物血藥濃度在0.43~5.5 μg/m1;伏立康唑血藥濃度/伏立康唑氮氧化物血藥濃度的比值在0.63~20之間。在本研究過程中1名患者使用伏立康唑后,臨床醫(yī)生根據(jù)其血液樣品監(jiān)測(cè)結(jié)果對(duì)患者進(jìn)行2次給藥方案調(diào)整,最終使伏立康唑血藥谷濃度在有效濃度范圍內(nèi)(1~5 μg/m1),具體監(jiān)測(cè)結(jié)果見表2。在此過程中,通過TDM監(jiān)測(cè),臨床醫(yī)生及時(shí)調(diào)整給藥方案,避免低效治療并降低發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

    表2 患者血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果(ρB/μg·ml-1)

    3 討論

    3.1 檢測(cè)指標(biāo)成分的選擇

    伏立康唑主要在肝臟通過CYP450的同工酶CYP2C19代謝,主要代謝產(chǎn)物為無抗菌活性的伏立康唑氮氧化物,血漿中約占72%。CYP2C19酶呈基因多態(tài)性,其在不同人種、不同基因型患者的伏立康唑代謝具有明顯差異。在給予相同劑量伏立康唑后,因代謝的明顯差異,導(dǎo)致體內(nèi)血藥濃度變化較為明顯,從而引起治療效果不佳或者不良反應(yīng)增加。本研究擬考察伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的濃度來提高治療效果,從而達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的。同時(shí)為下一步擬合CYP2C19酶多態(tài)性及伏立康唑、伏立康唑氮氧化物濃度的關(guān)系提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

    3.2 流動(dòng)相的選擇

    伏立康唑是三唑類化合物,采用甲醇-乙腈溶劑系統(tǒng)流動(dòng)相,干擾現(xiàn)象比較嚴(yán)重,在流動(dòng)相中加入適量鹽和三乙胺可抑制其拖尾,改善峰形。本研究曾分別考察了加入不同比例三乙胺、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值對(duì)峰形的影響。發(fā)現(xiàn)0.025 mol/L磷酸二氫鈉(三乙胺400 μl/L,用0.25 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH=7.0)-乙腈(67∶33)作為流動(dòng)相時(shí),峰形對(duì)稱,分離效果較好,檢測(cè)時(shí)間適宜,從而選擇其作為流動(dòng)相。

    3.3 提取溶媒的選擇

    本研究采用以乙腈為沉淀劑的蛋白沉淀法處理血液樣品。采用此方法時(shí),干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%,并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%,按照《中國藥典》四部通則9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則,可作為提取方法。

    3.4 檢測(cè)波長的選擇

    255 nm、276 nm分別為伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的最大吸收波長,在測(cè)定部分患者血液樣品時(shí)發(fā)現(xiàn):檢測(cè)波長為276 nm時(shí),伏立康唑氮氧化物的干擾小,測(cè)定準(zhǔn)確性好;檢測(cè)波長為255 nm時(shí),伏立康唑的響應(yīng)值高,精密性好,所以選擇雙波長檢測(cè)。

    3.5 臨床標(biāo)本的測(cè)定

    由于血液科用藥品種多,用藥方案多變,本研究采用常見的環(huán)孢素A+伏立康唑的患者作為對(duì)象,文獻(xiàn)報(bào)道[12]:環(huán)孢素A和伏立康唑具有相互作用,伏立康唑影響環(huán)孢素A的血藥濃度,同時(shí)兩者均有肝毒性,本研究擬通過監(jiān)測(cè)患者(同時(shí)使用環(huán)孢素A藥物)伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的血藥濃度,為個(gè)體化給藥方案提供數(shù)據(jù)支持,為降低血液科患者這一特殊人群發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)做前期的研究準(zhǔn)備工作。

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