GeneXpert MTB/RIF技術(shù)診斷肺結(jié)核及 利福平耐藥性的價(jià)值

吳海燕 葉志堅(jiān) 王霞芳 虞忻 吳妹英

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的肺部慢性傳染性疾病，是危害人類生命健康的主要疾病之一，已成為全世界公共衛(wèi)生面臨的重大威脅。我國是全球結(jié)核病高發(fā)國家之一，據(jù)2018年WHO[1]報(bào)告的最新數(shù)據(jù)顯示，2017年估算我國新發(fā)肺結(jié)核患者89.5萬例，位居全球第二位；耐藥結(jié)核病的發(fā)病率為7.1%，疫情依然嚴(yán)峻。減少肺結(jié)核及耐藥結(jié)核病的傳播，提高肺結(jié)核及耐藥結(jié)核病的診斷率，對結(jié)核病的防控有著十分重要的意義。由于肺結(jié)核臨床癥狀隱匿，早期發(fā)現(xiàn)及診斷活動性肺結(jié)核及耐藥肺結(jié)核已成為臨床工作者需要迫切解決的問題。

傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法有兩種，一是染色涂片法，是臨床上最便捷快速的診斷方法[2]，但因受制于痰液中分枝桿菌數(shù)量，此方法僅能檢出少部分活動性結(jié)核病患者，漏檢率很高，且無法區(qū)別MTB和非結(jié)核分支桿菌(NTM)。二是MTB培養(yǎng)、MTB藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)，不僅能取得病原學(xué)結(jié)果，還能進(jìn)行耐藥性檢測，但實(shí)驗(yàn)室方法繁瑣，耗時(shí)長，無法滿足快速診斷及開展有效抗結(jié)核治療的臨床需求。GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert法”)是目前國際上比較流行的檢測方法，主要用于檢測臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群DNA和利福平耐藥相關(guān)的ropB基因突變，一般2 h內(nèi)即可出結(jié)果。因其速度快，方法簡單，操作便捷，具有較高敏感度、特異度，得到廣泛關(guān)注與認(rèn)可[3-4]。

本研究對蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院(蘇州市第五人民醫(yī)院)收治的981例疑似肺結(jié)核患者進(jìn)行痰及BALF兩種標(biāo)本的檢測，包括涂片抗酸染色鏡檢(簡稱“涂片法”)、GeneXpert法、BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960法”)及固體藥敏比例法藥敏試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)的檢測結(jié)果，同時(shí)比較3種方法對痰標(biāo)本和BALF標(biāo)本的檢出陽性率，探討 GeneXpert法檢測在診斷肺結(jié)核及其耐藥性方面的臨床價(jià)值。

資料和方法

一、研究對象

搜集蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院(蘇州市第五人民醫(yī)院)結(jié)核病科2017年8月至2018年11月因疑似肺結(jié)核收治住院的981例患者為研究對象，經(jīng)臨床診斷最終確診結(jié)核病患者862例，男581例，女281例，年齡11～85歲，中位年齡54歲；非結(jié)核病患者119例，男77例，女42例，年齡18～74歲，中位年齡55歲；包括肺部感染84例，肺部腫瘤11例，慢性阻塞性肺病24例。

二、 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)納入患者均為初次來我院就診者。胸部CT檢查符合肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)，可有或無咳嗽、咯血等呼吸道癥狀。(2)所有患者具有完整臨床資料及影像學(xué)資料。(3)抗結(jié)核藥物治療前均取3個(gè)合格的痰標(biāo)本。(4)所有患者均行電子氣管鏡檢查，獲得3個(gè)合格的肺泡灌洗液標(biāo)本。(5)所有患者完成2個(gè)月隨訪。肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患者是否有密切的肺結(jié)核患者接觸史，結(jié)合臨床表現(xiàn)及相應(yīng)的必要實(shí)驗(yàn)室檢查，最終診斷依據(jù)病原學(xué)檢查結(jié)果(細(xì)菌學(xué)陽性)，如無細(xì)菌學(xué)依據(jù)，則按2017年中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會頒布的《WS 288—2017結(jié)核病診斷》中臨床診斷的新標(biāo)準(zhǔn)[5]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)HIV感染者。(2)既往曾行抗結(jié)核藥物治療的患者。

三、檢測方法

1.標(biāo)本的采集：(1)每例入選患者均收集即時(shí)痰、夜間痰及晨痰標(biāo)本3份(每份樣品量在3～5 ml)。分別進(jìn)行痰涂片、MGIT 960和GeneXpert檢測，若MGIT 960培養(yǎng)陽性，則進(jìn)行固體比例法藥敏試驗(yàn)。(2)肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本留取：每例入選的患者均行電子支氣管鏡檢查(電子支氣管鏡型號Olympus BF-290)，用20 ml注射器于活檢孔快速注入36 ℃滅菌生理鹽水100 ml，立即用負(fù)壓吸引回收共計(jì)60 ml左右BALF，其中有40 ml分成3份，分別行痰涂片、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測，若MGIT 960培養(yǎng)陽性，則進(jìn)行固體比例法藥敏試驗(yàn)。

2.涂片抗酸染色：痰涂片按照文獻(xiàn)[6]中相關(guān)要求進(jìn)行涂片、染色、鏡檢并報(bào)告結(jié)果。即取標(biāo)本進(jìn)行涂片后，在火焰上加熱固定，加石炭酸復(fù)紅溶液，再次加熱至蒸汽出現(xiàn)，約5 min后用水洗，加入脫色劑，輕搖玻片至無紅色脫落，再次水洗，加入復(fù)染液，再次染色約1 min；晾干玻片，最后放置在顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果判斷：①陰性為連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；②陽性為找抗酸桿菌菌數(shù)1～8條/300個(gè)視野；③陽性(+)：3～9條/100視野，連續(xù)觀察300個(gè)視野；④陽性(++)：1～9條/10個(gè)視野，連續(xù)觀察100個(gè)視野；⑤陽性(+++)：1～9條/1個(gè)視野；⑥陽性(++++)：≥10條/1個(gè)視野。

3. MGIT 960培養(yǎng):按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[7]中的相關(guān)要求進(jìn)行。具體步驟一：制備培養(yǎng)基。從冰箱中取出培養(yǎng)基，將溫度恢復(fù)到室溫，并在培養(yǎng)管上編制序列號，并寫上患者姓名、培養(yǎng)日期、痰涂片編號。步驟二：標(biāo)本前去污染處理。取2 ml痰標(biāo)本，并在預(yù)處理管中加4%NaOH，加入量是痰標(biāo)本的1～2倍，于振蕩器上振蕩30～60 s，并室溫放置10～15 min(不得超過20 min)。步驟三：接種。取0.1 ml前處理液，通過無菌操作接種在培養(yǎng)基的斜面上，每份標(biāo)本均需同時(shí)接種在2支酸性改良羅氏培養(yǎng)基上，并在37 ℃溫箱中培養(yǎng)。步驟四：孵育。接種后3、7 d每周觀察1次直至8周并記錄菌落生長情況，對于生長的菌落需經(jīng)抗酸染色確認(rèn)是否為分枝桿菌。結(jié)果判讀：陰性為斜面無分枝桿菌菌落生長；陽性(+)：菌落占斜面面積1/4；分枝桿菌培養(yǎng)陽性(++)：菌落占斜面面積1/2；陽性(+++)：菌落占斜面面積3/4；陽性(++++)：菌落占滿整個(gè)斜面。

4.固體比例法藥敏試驗(yàn)(簡稱“比例法藥敏試驗(yàn)”):按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[8]中的相關(guān)要求，使用接種環(huán)刮取生長旺盛的菌落置于加有少許緩沖液的磨菌管底部，充分研磨成乳酪樣均勻菌液，用比濁管比濁配成1 mg/ml菌液，稀釋配比，最終制成10-2mg/ml和10-4mg/ml細(xì)菌液。使用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)(22 SWG)蘸取1環(huán)(即0.01 ml)細(xì)菌液，通過劃線法(分別對照及接種)均勻接種至培養(yǎng)基表面，應(yīng)盡可能的使菌液均勻分散于培養(yǎng)基的斜面。將其置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)，4周報(bào)告結(jié)果。

5.GeneXpert 法：實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照GeneXpert MTB/RIF試劑盒說明書進(jìn)行，將樣本加入1～2倍體積的4%NaOH溶液混合，振蕩15～30 s，充分液化后，室溫靜置15 min，用專用無菌吸管吸取2 ml處理好的標(biāo)本轉(zhuǎn)移到樣本反應(yīng)盒中，然后將反應(yīng)盒放置到GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)儀器中，儀器開始自動化檢測，約2 h反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)依照探針的循環(huán)閾值(Ct)自動判斷檢測樣本中是否存在MTB，若存在MTB，則判斷是否有利福平耐藥。

四、儀器及主要試劑

金胺O染色液購于杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。MTB染色液、酸性和中性羅氏培養(yǎng)基、藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基及對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基，均購于美國BD公司。GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)及配套試劑購于美國Cepheid公司。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel表格錄入數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以“率(%)”表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算各方法的檢測效能指標(biāo)。

結(jié) 果

一、三種檢測方法對初診疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的檢測效能

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert 法檢測肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的敏感度和特異度分別為32.02%(276/862)、100.00%(119/119)；53.25%(459/862)、100.00%(119/119)；53.02%(457/862)、96.64%(115/119)。見表1。

二、三種檢測方法對初診疑似肺結(jié)核患者BALF標(biāo)本的檢測效能

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，涂片鏡檢、BACTEC MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測肺結(jié)核患者BALF標(biāo)本的敏感度和特異度分別為31.32%(270/862)、100.00%(119/119)；69.37%(598/862)、100.00%(119/119)；72.97%(629/862)、96.64%(115/119)。見表2。

表1 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，3種方法對肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的檢測效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表2 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)3種方法對肺結(jié)核患者BALF標(biāo)本的檢測效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

三、關(guān)于 GeneXpert法檢測利福平耐藥性的結(jié)果分析

在MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert 法檢測均陽性的527例肺結(jié)核患者中，比例法藥敏試驗(yàn)檢測出對利福平耐藥者28例，而GeneXpert 法檢測結(jié)果對利福平耐藥者26例，其余2例提示敏感。比例法藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果對利福平敏感者共有499例，GeneXpert法檢測結(jié)果為敏感者497例，其余2例提示耐藥。追蹤2例傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)敏感但GeneXpert法檢測對利福平耐藥的患者，對發(fā)現(xiàn)上述不一致菌株的ropB基因核心區(qū)域進(jìn)行測序，1例測序結(jié)果為耐藥，1例測序結(jié)果為敏感(GeneXpert 法檢測結(jié)果均為極低)。對GeneXpert和MGIT 960法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.612，P<0.001,兩種檢測方法具有較好一致性。以固體比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert 法對利福平耐藥檢測的敏感度為92.86%(26/28)，特異度為99.60%(497/499)。

討 論

我國近年來結(jié)核病發(fā)病率控制緩慢，據(jù)2010年全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查[9]及2018年WHO報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)核病，包括耐藥結(jié)核病疫情依然相當(dāng)嚴(yán)峻。早期快速及精確的診斷肺結(jié)核及發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病患者，是控制及減少結(jié)核病及耐藥結(jié)核病傳播的關(guān)鍵，對于結(jié)核病的防治有著十分重要的意義。肺結(jié)核診斷較為困難，既往傳統(tǒng)標(biāo)本找抗酸桿菌涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)為診斷肺結(jié)核常用的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，痰涂片雖然便捷迅速，但敏感度低，漏檢率高，傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)技術(shù)是檢測MTB的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖然敏感度相對于痰涂片有所提高，但實(shí)驗(yàn)室方法繁瑣，對實(shí)驗(yàn)室的生物安全設(shè)施及操作人員的技術(shù)水平要求高，且耗時(shí)長，需1～2個(gè)月出結(jié)果，無法滿足快速診斷的臨床需求。

隨著結(jié)核病分子診斷技術(shù)的提高，自2010年12月WHO批準(zhǔn)了GeneXpert技術(shù)可應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷，整個(gè)流程僅需2.5 h。2017年衛(wèi)生部頒布的《WS 288—2017結(jié)核病診斷》已將分子診斷技術(shù)GeneXpert列為診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)。趙冰等[10]、Bajrami等[11]均有文獻(xiàn)提出GeneXpert MTB/RIF可快速診斷肺結(jié)核，特異度強(qiáng)，敏感度高，同時(shí)還可檢測是否有利福平耐藥，優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法。在標(biāo)本選擇上，取痰液標(biāo)本為最簡便、快捷的方法，但常常受到氣道、口腔等污染，陽性率低，且部分患者痰量少無法行此檢查。而支氣管鏡灌洗標(biāo)本是直接經(jīng)支氣管內(nèi)灌洗后取出，能顯著減少標(biāo)本污染，進(jìn)而可提高檢測和診斷的準(zhǔn)確性[12]。

筆者通過研究981例疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，對3種檢測方法的檢測效能進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)痰標(biāo)本GeneXpert檢測的敏感度明顯高于涂片，與MGIT 960法檢測結(jié)果相當(dāng)，這與王蔚等[13]學(xué)者的研究結(jié)果相同。表明GeneXpert臨床應(yīng)用價(jià)值優(yōu)于其他2種檢查方法，可提高肺結(jié)核診斷的陽性率。另外，本次研究中還對比痰及BALF兩種標(biāo)本進(jìn)行3種不同檢測方法的敏感度，發(fā)現(xiàn)除了涂片找抗酸桿菌，BALF標(biāo)本其他2種實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的敏感度均明顯高于痰標(biāo)本。這與劉旭輝等[14]研究結(jié)果相近，進(jìn)而證實(shí)了BALF標(biāo)本臨床應(yīng)用價(jià)值高于傳統(tǒng)痰標(biāo)本，可在痰標(biāo)本基礎(chǔ)之上再次提高肺結(jié)核病原學(xué)檢查陽性率。對于BALF標(biāo)本中找抗酸桿菌涂片結(jié)果低于痰標(biāo)本，分析原因與行氣管鏡檢查前已有部分痰標(biāo)本病原學(xué)檢查陽性的患者接受抗結(jié)核藥物治療，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌菌量減少有關(guān)。

以固體比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert法檢測利福平耐藥性的敏感度為92.86%，特異度為99.60%。這與韓丹等[15]和Weyer等[16]研究的結(jié)果接近。經(jīng)上述研究發(fā)現(xiàn)，GeneXpert 法檢測是否耐利福平的敏感度及特異度均較高。且其檢測結(jié)果與固體比例法藥敏試驗(yàn)具有較好一致性，故真實(shí)可靠，可高效地提高早期耐利福平肺結(jié)核的發(fā)現(xiàn)率，為耐藥肺結(jié)核早期診斷及個(gè)體化治療提供用藥指導(dǎo)。追蹤2例固體比例法藥敏試驗(yàn)敏感但GeneXpert 法檢測對利福平耐藥的患者，對發(fā)現(xiàn)不一致菌株進(jìn)行ropB基因核心區(qū)域測序，結(jié)果1例測序報(bào)告為耐藥，1例測序報(bào)告為敏感(GeneXpert法檢測結(jié)果均為極低)，故對待GeneXpert 法檢測結(jié)果弱陽性，提示利福平耐藥的患者需謹(jǐn)慎對待，需結(jié)合固體比例法藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果進(jìn)一步明確[17]。因本研究人群中未統(tǒng)計(jì)復(fù)治肺結(jié)核和未行電子氣管鏡檢查的初發(fā)初治的肺結(jié)核患者，故對利福平耐藥的檢出率較低，不能代表全國耐藥結(jié)核病的發(fā)病水平。

綜上所述，GeneXpert法具有早期、快速、準(zhǔn)確的診斷肺結(jié)核等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用價(jià)值優(yōu)于涂片及MGIT 960培養(yǎng)及固體比例法藥敏試驗(yàn)，在早期診斷肺結(jié)核及耐利福平肺結(jié)核方面有著較好的應(yīng)用前景。同時(shí)還證明了氣管鏡灌洗液標(biāo)本臨床應(yīng)用價(jià)值高于傳統(tǒng)痰標(biāo)本，可在痰標(biāo)本基礎(chǔ)上再次提高肺結(jié)核病原學(xué)檢查的陽性率。故在疾病早期，特別是痰標(biāo)本病原學(xué)檢查均為陰性的患者，因盡早行電子支氣管鏡檢查，可明顯提高肺結(jié)核，特別是菌陰肺結(jié)核的病原學(xué)檢出率。