兩種分子診斷技術(shù)對(duì)提高結(jié)核病病原學(xué) 檢測(cè)陽性率的評(píng)價(jià)研究

宋紅煥 邵燕 李燕 李國莉 陳誠 竺麗梅 陸偉

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染疾病[1]，目前結(jié)核病的主要診斷手段有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、影像學(xué)及免疫學(xué)輔助檢查。萋-尼染色法因操作簡單、成本低、生物安全要求較低等因素，目前仍廣泛應(yīng)用于各級(jí)結(jié)核病定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)，但因其敏感度較低，痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌只有大于10 000條/ml方可檢出，敏感度僅為30%左右[2-3]。如此，一方面造成漏診誤診，導(dǎo)致患者的病情加重；另一方面患者的傳染期延長，對(duì)人群健康造成了極大的威脅。所以，采用適宜的技術(shù)提高病原學(xué)陽性率對(duì)于患者的早期診斷和治療非常重要。2017年7月，江蘇省在全省范圍內(nèi)推廣分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，主要是基因芯片、線性探針、半巢式全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)(以下簡稱：GeneXpert技術(shù))、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸技術(shù)(以下簡稱：恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù))。其中基因芯片與線性探針主要用于市級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行耐藥結(jié)核病篩查；GeneXpert與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要用于縣(區(qū))級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，以發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者。因2016—2017年江蘇省部分縣(區(qū))根據(jù)項(xiàng)目要求陸續(xù)開展分子檢測(cè)，故本文選取2015年數(shù)據(jù)為基線，與2018年數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，綜合評(píng)價(jià)GeneXpert技術(shù)與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)兩種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核病病原學(xué)陽性率的提高水平及其檢測(cè)效能。

材料和方法

一、資料來源

從《中國疾病預(yù)防控制結(jié)核病專報(bào)系統(tǒng)》常規(guī)監(jiān)測(cè)報(bào)表肺結(jié)核患者登記情況統(tǒng)計(jì)獲取江蘇省23個(gè)使用GeneXpert技術(shù)的縣(區(qū)) [以下簡稱A類縣(區(qū))]和46個(gè)使用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的縣(區(qū))[以下簡稱B類縣(區(qū))]2018年活動(dòng)性結(jié)核病患者信息(單純結(jié)核性胸膜炎除外)，以及全年確診活動(dòng)性肺結(jié)核患者的總例數(shù)。同樣的方法獲取2015年(尚未推廣分子生物學(xué)技術(shù))兩類縣(區(qū))數(shù)據(jù)。

二、江蘇省縣(區(qū))級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院分子檢測(cè)技術(shù)使用情況

A類縣(區(qū))：江蘇省23個(gè)使用GeneXpert技術(shù)的縣區(qū)，該類縣(區(qū))臨床路徑為結(jié)核病疑似患者首先進(jìn)行痰涂片檢測(cè)，涂片陰性且綜合影像學(xué)、免疫學(xué)、臨床癥狀等高度疑似結(jié)核病患者采用GeneXpert技術(shù)進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行痰培養(yǎng)檢測(cè)。

B類縣(區(qū))：江蘇省46個(gè)使用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的縣(區(qū))，該類縣(區(qū))臨床路徑為結(jié)核病疑似患者首先進(jìn)行痰涂片檢測(cè)，涂片陰性且綜合影像學(xué)、免疫學(xué)、臨床癥狀等高度疑似結(jié)核病患者采用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行痰培養(yǎng)檢測(cè)。

兩類縣(區(qū))結(jié)核病疑似患者綜合細(xì)菌性檢測(cè)、影像學(xué)、免疫學(xué)、臨床癥狀等確診是否為結(jié)核病患者；病原學(xué)陽性患者為痰涂片、痰培養(yǎng)或分子生物學(xué)3種技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)，任何一種技術(shù)陽性者(分子檢測(cè)陽性且培養(yǎng)陽性者計(jì)入分子檢測(cè)陽性數(shù)，不重復(fù)記錄在培養(yǎng)陽性患者人數(shù)中)。為方便統(tǒng)一比較，故在2015年和2018年數(shù)據(jù)中均將單純結(jié)核性胸膜炎排除，并剔除病理檢測(cè)陽性患者，分別獲取兩類縣(區(qū))2018年病原學(xué)陽性患者例數(shù)，以及3種方法分別檢出陽性患者例數(shù)與陽性率，并與2015年(尚未推廣分子生物學(xué)技術(shù))的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。比較兩類縣(區(qū))2015與2018年病原學(xué)陽性率以及2018年推廣分子生物學(xué)技術(shù)后，兩類縣(區(qū))的病原學(xué)陽性率。

三、試劑與材料

痰培養(yǎng)采用L-J羅氏固體培養(yǎng)法，培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，GeneXpert技術(shù)試劑盒購自美國賽沛公司，恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)試劑盒購自廣州迪澳生物科技有限公司，試劑均由江蘇省疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)一招標(biāo)采購下發(fā)至各個(gè)縣(區(qū))。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩類縣(區(qū))不同年份臨床確診肺結(jié)核患者的病原學(xué)陽性率比較

比較兩類縣(區(qū))2015年與2018年病原學(xué)陽性率，發(fā)現(xiàn)兩種分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)肺結(jié)核診斷病原學(xué)陽性率均有明顯的提高，其中A類縣(區(qū))病原學(xué)陽性率從27.8%提高至52.9%，B類縣(區(qū))陽性率從33.0%提高至50.6%。兩類縣(區(qū))2015年與2018年病原學(xué)陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1270.00，P=0.000;χ2=860.00，P=0.000);分別比較2015年和2018年兩類縣(區(qū))的病原學(xué)陽性率， 2015年B類縣(區(qū))病原學(xué)陽性率高于A類縣(區(qū)),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=80.10，P=0.000)；2018年推廣分子生物學(xué)技術(shù)后， A類縣(區(qū))病原學(xué)陽性率高于B類縣(區(qū))，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.60，P=0.001)。

二、2018年兩類縣(區(qū))活動(dòng)性肺結(jié)核患者不同檢測(cè)技術(shù)病原學(xué)檢測(cè)陽性率

2018年A類縣(區(qū))確診活動(dòng)性肺結(jié)核患者8176例，其中病原學(xué)陽性患者4327例(包括涂片3117例，痰培養(yǎng)116例，GeneXpert技術(shù)1094例)，病原學(xué)陽性率為52.9%(涂片38.1%，痰培養(yǎng)1.4%，GeneXpert 13.4%)，GeneXpert技術(shù)檢測(cè)陽性占總病原學(xué)陽性的比率為25.3%(1094/4327)；B類縣(區(qū))確診活動(dòng)性肺結(jié)核患者12 196例，其中病原學(xué)陽性患者6171例(包括涂片4823例，痰培養(yǎng)461例，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)887例)病原學(xué)陽性率分別為50.6%(涂片39.5%，痰培養(yǎng)3.8%，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)7.3%)，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)陽性占總病原學(xué)陽性的比率為14.4%(887/6171)，見表2。

討 論

近些年恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和GeneXpert兩種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在基層實(shí)驗(yàn)室得到了普遍推廣[4]，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)通過聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對(duì)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸染料結(jié)合后發(fā)出檢測(cè)信號(hào)由此判斷標(biāo)本中是否存在病原體,該技術(shù)具有較高的敏感度和特異度[5-6]。GeneXpert技術(shù)使用全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該技術(shù)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB基因區(qū)設(shè)定引物、探針，擴(kuò)增熒光檢測(cè)其是否發(fā)生基因突變，檢測(cè)標(biāo)本中是否含有結(jié)核分枝桿菌及是否對(duì)利福平耐藥[7]。近年來國內(nèi)多中心試驗(yàn)驗(yàn)證評(píng)估結(jié)果顯示，GeneXpert技術(shù)檢測(cè)結(jié)核病的敏感度為96%～99%，特異度為86%～90%[8]，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)結(jié)核病的敏感度為83%～89%，特異度為92%～94%[5]。

表1 兩類縣(區(qū))不同年份臨床確診肺結(jié)核患者的病原學(xué)陽性率統(tǒng)計(jì)

表2 2018年兩類縣(區(qū))活動(dòng)性肺結(jié)核患者不同檢測(cè)技術(shù)病原學(xué)檢測(cè)陽性率統(tǒng)計(jì)

本研究中主要關(guān)注兩種技術(shù)在臨床診斷中病原學(xué)陽性率的提高，使用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的縣(區(qū))陽性率從33.0%提高至50.6%，使用GeneXpert技術(shù)的縣區(qū)病原學(xué)陽性率從27.8%提高至52.9%，分析2018年兩類縣區(qū)病原學(xué)陽性率發(fā)現(xiàn)兩種技術(shù)對(duì)當(dāng)?shù)氐牟≡瓕W(xué)陽性率均有一定程度提高，GeneXpert技術(shù)與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)占總病原學(xué)陽性比率分別為25.3%與14.4%，其次2018年相比于2015年，兩類縣(區(qū))的痰涂片陽性率也有一定程度的提高，A類縣區(qū)由27.8%提高至38.1%，B類縣區(qū)由33.0%提高至39.5%，另外涂陰患者的痰培養(yǎng)對(duì)病原學(xué)陽性率也有部分貢獻(xiàn)，故痰涂片、痰培養(yǎng)、分子檢測(cè)三種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)兩類縣區(qū)病原學(xué)陽性率的明顯提高有重要意義。

總之，兩種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有安全、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為結(jié)核病的早診斷、早治療提供了新依據(jù)[9],各級(jí)實(shí)驗(yàn)室可因地制宜選取適宜的技術(shù)開展結(jié)核病分子生物學(xué)檢測(cè)。

另外，分子生物學(xué)可檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核酸，但是不能區(qū)別死菌和活菌，故建議在實(shí)際工作中同步開展痰培養(yǎng)，一方面提高結(jié)核病診斷能力，另一方面也為后期菌種鑒定與藥物敏感性試驗(yàn)做準(zhǔn)備。細(xì)菌學(xué)方法與分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)合診斷、相互補(bǔ)充，可以為臨床診斷獲得較高的病原學(xué)陽性率，有利于對(duì)患者順利開展進(jìn)一步診療。