消瘀泄?jié)犸媽υ煊皠┠I病大鼠保護作用的實驗研究

陸明　胡鵬飛　林冬銘　黃抒偉

[摘要] 目的 探討消瘀泄?jié)犸媽υ煊皠┠I?。–IN）大鼠是否具有保護作用及其相關(guān)機制。 方法 將24只雄性SD大鼠隨機分為4組：正常組（A組）、CIN組（B組）、消瘀泄?jié)犸嫷蛣┝拷M（C組）和消瘀泄?jié)犸嫺邉┝拷M（D組）。造模后48 h處死大鼠，測定各組大鼠血清肌酐、尿素氮水平，HE和PAS染色觀察各組腎臟組織病理變化，Western Blot檢測各組Bax、Bcl-2、Caspase-3、P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達量。 結(jié)果 造模48 h后，與A組相比，B組大鼠血清肌酐和尿素氮水平均明顯升高（P<0.05）;腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡樣變性、管腔變大及腎間質(zhì)水腫，腎小球組織未發(fā)現(xiàn)明顯改變;Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表達上調(diào)（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達同時上調(diào)（P<0.05）。與B組相比，C、D組血清肌酐和尿素氮水平明顯下降（P<0.05）;腎小管上皮空泡樣變性減少;Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表達下調(diào)（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達同時下調(diào)（P<0.05）。 結(jié)論 消瘀泄?jié)犸媽υ煊皠┠I病大鼠具有預(yù)防作用，其機制可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路過度激活從而抑制腎小管上皮細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 消瘀泄?jié)犸?造影劑腎病;凋亡;PI3K/Akt/mTOR信號通路

[中圖分類號] R692? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）02-0037-04

造影劑腎?。–ontrast induced nephropathy，CIN）是指造影劑引起的腎功能急驟下降[1]。隨著造影劑在放射學(xué)診斷檢查和介入手術(shù)中的普遍應(yīng)用，CIN已成為一種臨床常見的并發(fā)癥，CIN發(fā)生率在普通人群中為0.6%～2.3%，高危人群中可達90%[2]，是僅次于腎灌注不足和腎毒性藥物引起的醫(yī)院獲得性急性腎損傷的第三大常見原因[3]。實際工作中對CIN的認識仍然不夠，目前尚無有效措施逆轉(zhuǎn)CIN病程進展，最好的治療方法就是預(yù)防，而在預(yù)防CIN發(fā)生方面方法不多，目前臨床療效較為肯定的僅有水化。消瘀泄?jié)犸嬋∽匀珖现嗅t(yī)李學(xué)銘臨床驗方，該方在氣虛夾瘀濁的慢性腎病患者中已取得良好療效[4]，本研究希望通過中西醫(yī)結(jié)合手段進一步研究中藥方劑在CIN中的應(yīng)用，明確消瘀泄?jié)犸媽IN大鼠腎功能的保護作用及探討其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

選擇SPF級雄性SD大鼠24只，體重（220±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供，動物生產(chǎn)單位為上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。消瘀泄?jié)犸嬋接牲S芪30 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龍12 g、制軍10 g、車前草20 g 組成，以上中藥均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥房提供;吲哚美辛（1 mg/100 g）和 N-硝基-L-精氨酸甲酯（1 mg/100 g）均購自Sigma 公司;復(fù)方泛影葡胺注射液（20 mL/12 g）購自西安漢豐藥業(yè)有限責(zé)任公司（國藥準字H20034058）。廣譜磷酸酶抑制劑混合物（規(guī)格：1 mL）和熒光二抗（規(guī)格：100 μL）均購自博士德生物工程有限公司;cleaved-Caspase-3抗體、GAPDH抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Akt抗體、P-Akt抗體、mTOR抗體、P-mTOR抗體均購自Cell Signaling Technology公司，規(guī)格均為100 μL。于2016年7月～2018年2月進行試驗。

1.2 動物造模和分組

隨機分為4組，6只/組：正常組（A組）、CIN組（B組）、消瘀泄?jié)犸嫷蛣┝拷M（C組）和消瘀泄?jié)犸嫺邉┝拷M（D組）。其中B、C、D組按照參考文獻制備CIN 模型[4]，具體方法如下：大鼠造模前禁水12 h，自由進食。稱重后按10%水合氯醛0.32 mL/100 g（購自陜西盤龍醫(yī)藥物流有限公司，規(guī)格：500 mL，國藥準字H37022673）腹腔注射麻醉。尾靜脈注射10 mg/kg吲哚美辛;15 min后注射10 mg/kg L-NAME;15 min后注射2 g/kg的泛影葡胺。A、B組：灌胃等劑量生理鹽水。C、D組于造模前1周開始每日灌胃消瘀泄?jié)犸嫾鍎?，灌胃量分別為成人標準體重（60 kg）常規(guī)用量20、50倍。各組均未予水化治療。

1.3 腎功能和組織形態(tài)學(xué)檢測

1.3.1 腎功能檢測? 造模后48 h 處死動物，尾靜脈采血，分離血清。由全自動生化分析儀測定血清肌酐和尿素氮水平。

1.3.2 HE和PAS染色? 取大鼠腎臟組織，經(jīng)多聚甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制作病理切片，切片厚度4 μm，HE染色和PAS染色后光學(xué)顯微鏡下觀察[5，6]。

1.4 Western Blot法檢測

取大鼠腎臟組織標本液氮研碎，加入裂解液，經(jīng)勻漿離心后，取上清液用BCA法測定蛋白濃度，變性后-20℃保存。取各組樣本50 μg，進行12% SDS-PAGE并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用3% BSA室溫搖床封閉2 h，加入3%封閉液稀釋的抗體（1：1000稀釋），4℃冷庫搖床過夜，用TBST洗滌15 min×3次。然后，加入二抗（1：2000稀釋），室溫下?lián)u床孵育2 h后，用TBST洗滌15 min×3次。ECL發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Imgae J軟件進行圖像分析，以GAPDH（1：1000稀釋）作為內(nèi)參照對比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對含量[7]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差進行分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消瘀瀉濁飲對CIN大鼠腎功能的影響

見表1。與A組相比，B組大鼠血清肌酐和尿素氮水平明顯升高（P<0.05）;與B組相比，C、D組血清肌酐和尿素氮水平顯著下降（P<0.05），且D組較C組肌酐降低更明顯（P<0.05），D組較C組尿素氮降低不明顯，無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.438>0.05）。

表1? ?各組大鼠腎功能指標比較（x±s，μmol/L）

注：與B組相比，#P<0.05 ;與C組相比，*P<0.05

2.2 HE染色

A組大鼠腎小管、腎小球、腎間質(zhì)區(qū)未見明顯異常，B組大鼠可見腎小管上皮細胞空泡樣變性，管腔明顯擴大，刷狀緣部分脫落，間質(zhì)水腫。C、D組大鼠與B組相比，均能有效減輕大鼠腎小管-間質(zhì)病變，腎小管上皮細胞空泡樣變區(qū)域明顯減少，且D組較C組明顯。見封三圖2。

2.3 PAS染色

PAS染色顯示：A組腎小球血管袢薄而清晰，較少糖原沉積;與A組相比，B、C、D組腎小球基底膜、系膜均未見明顯糖原沉積和增生，各組間未見明顯差異。見封三圖3。

2.4 Western Blot法檢測

Western Blot檢測結(jié)果顯示：與A組相比，B組大鼠腎臟組織Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表達上調(diào)（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達均同時上調(diào)（P<0.05）;與B組相比，C、D組Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表達下調(diào)（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達均同時下調(diào)（P<0.05）。見圖1和表2。

3討論

造影劑腎?。–ontrast-induced nephropathy，CIN）又稱造影劑誘導(dǎo)的急性腎損傷，被定義為造影劑暴露后48～72 h后血肌酐絕對值較基礎(chǔ)值升高≥0.5 mg/dL（44.2 μmol/L）或相對升高≥25%，并排除其他可能引起腎損傷的原因[8]。雖然大多數(shù)CIN患者血肌酐1～4周可恢復(fù)正常水平，但仍不能認為CIN發(fā)病是一良性的、一過性的肌酐增高。Maioli等[9]研究顯示：腎小球濾過率<60 mL/min的PCI患者中CIN的發(fā)病率為12.1%，其中18.6%的患者3個月后的肌酐清除率仍較基礎(chǔ)值減少25%，急性腎損傷可演變?yōu)槌掷m(xù)性腎損傷。對比劑對腎臟的毒性包括分子的直接化學(xué)毒性（離子性、含碘物質(zhì)）、滲透毒性及組分中與黏度相關(guān)的毒性[10，11]。目前研究認為直接腎小管毒性和氧化應(yīng)激是造影劑腎病的主要病理生理機制，而細胞凋亡在兩者中均發(fā)揮著重要的作用[12]。

消瘀泄?jié)犸嬘衫罾献浴夺t(yī)林改錯》“補陽還五湯”化裁而來。全方由黃芪30 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龍12 g、制軍10 g、車前草20 g 組成。大黃為君藥，具有通利逐瘀、蕩滌胃腸、清除邪濁之功;桃仁、牛膝和地龍具有活血祛瘀之功，共為臣藥;生黃芪為佐藥，補氣行血，加大活血化瘀之功;車前草利水通淋，導(dǎo)濁下行，是為使藥[13]。因此消瘀泄?jié)犸嬀哂信判乖煊皠?、減少造影劑滯留對腎臟的毒性作用;同時其活血化瘀能改善腎臟血流，減少氧化應(yīng)激對腎臟的損害。本研究通過復(fù)制CIN大鼠模型，結(jié)果顯示CIN大鼠組（B組）血清肌酐和尿素氮水平明顯升高，且出現(xiàn)腎小管上皮細胞空泡樣變性，刷狀緣部分脫落，間質(zhì)水腫，說明造影劑腎病大鼠造模成功，與既往研究相符[14]。與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫿M可減少腎小管上皮細胞空泡樣變性和腎間質(zhì)水腫，降低大鼠血清肌酐和尿素氮水平，從而改善CIN大鼠腎功能。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡[15]，而Bcl-2家族和caspase家族在細胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，特別是在線粒體途徑中。Bcl-2和bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜通透性改變的重要調(diào)節(jié)基因。它們的過表達可以控制上游cyt-c的釋放和下游caspase-3蛋白酶的活化并介導(dǎo)細胞凋亡[16]。本研究中，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫿MCaspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達下調(diào);說明消瘀泄?jié)犸嬁赡芡ㄟ^Bcl-2/Bax介導(dǎo)的線粒體凋亡信號傳導(dǎo)途徑抑制腎小管上皮細胞凋亡。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian aarget of rapamycin，mTOR）是一種進化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可受生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)和能量等多因素影響，可通過磷酸化其下游的靶蛋白，參與基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達，進而影響凋亡等的生物活性[17]。細胞外的生長因子和細胞因子可通過受體酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，并在PDK1的協(xié)同下磷酸化Akt使其激活?；罨腁kt磷酸化TSC2，而被磷酸化的TSC2將從負向調(diào)控Rheb活性增強，正向調(diào)控mTOR的活性[18]。本研究顯示：與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫿MP-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達下調(diào)，提示消瘀泄?jié)犸嫿M可有效地抑制過度激活的PI3K/Akt/mTOR信號通路。

本研究的局限性：本研究缺乏腎小管上皮細胞實驗，未能使用mTOR抑制劑雷帕霉素反證消瘀泄?jié)犸嬕种颇I小管上皮細胞凋亡是通過介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR信號通路，且消瘀泄?jié)犸嬀哂徐铕?、活血化瘀之功效，其對CIN大鼠的保護機制還可能與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬和細胞存活等通路相關(guān)[19-21]。

綜上所述，本研究證實：消瘀泄?jié)犸嬜鳛榕R床上治療慢性腎病患者的臨床驗方，其具有通利逐瘀等功效，可有效改善CIN大鼠腎功能，其機制可能是通過抑制過度激活的PI3K/Akt/mTOR信號通路從而抑制腎小管上皮細胞凋亡，但還需進一步的實驗證實。

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（收稿日期：2018-07-26）