黃連素對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的影響及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)變化

鄭海雅　蘭俊　呂雷立　黃振強(qiáng)

[摘要] 目的 探討黃連素在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用。 方法 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組（S組）、模型組（IR組）、黃連素組（H組）和黃連素+Exendin-（9-39）組（HE組）。S組給予生理鹽水及行假手術(shù)處理，IR組給予生理鹽水，H組給予黃連素，HE組給予黃連素+ Exendin-（9-39），三組制作大鼠腎臟缺血再灌注模型。觀察腎組織病理學(xué)改變，檢測造模前及造模12 h和24 h后血清中肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平及血清白細(xì)胞介素（IL）-10、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）以及腎組織中腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-6的含量。本次實(shí)驗(yàn)研究時間為2016年9～11月。 結(jié)果 模型制作成功，血清 BUN、Cr 水平在H組中低于IR組（P<0.05），而HE組低于H組（P<0.05）;IR組、H組、HE組中IL-10、IL-6、TNF-α、VEGF水平均高于S組（P<0.05），HE組IL-6、TNF-α水平較H組明顯降低（P<0.05）。四組IL-1β水平無明顯變化。 結(jié)論 黃連素能有效改善腎臟缺血再灌注大鼠的腎功能，其機(jī)制可能與抑制腎臟組織炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 黃連素;腎臟缺血再灌注;炎癥因子;保護(hù)作用

[中圖分類號] R692? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）02-0032-05

黃連素（berberine，BR）又稱小檗堿，是從黃連、黃柏等中藥中發(fā)現(xiàn)的生物堿，具有抗腫瘤[1，2]、抗炎[3，4]、抗菌[3-5]、抗氧化[6]、保護(hù)心血管[7，8]等諸多的藥理作用。近年來黃連素對急性損傷的保護(hù)作用已經(jīng)引起醫(yī)學(xué)研究者的重視[9]。1985年至今，國內(nèi)外開展大量有關(guān)黃連素對急性損傷保護(hù)作用的研究，證實(shí)黃連素通過減輕脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子水平等方式可對急性損傷起到保護(hù)作用。黃連素在大鼠心肌缺血再灌注中進(jìn)行廣泛研究[10，11]，但黃連素是否對缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）引起的腎臟損傷也具有保護(hù)效應(yīng)，至今鮮有報(bào)道。本文采用大鼠缺血再灌注模型，模擬腎臟缺血再灌注損傷，觀察黃連素對損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇40只成年雄性SD大鼠，體重為220～240 g，2016年9月購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2016-0011。動物飼養(yǎng)和處理均按照我院實(shí)驗(yàn)動物管理規(guī)定執(zhí)行。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)通過。黃連素（純度98%）購于上海阿拉丁試劑有限公司，Exendin-（9-39）購于上海浩然生物技術(shù)有限公司，尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、VEGF等酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。本次實(shí)驗(yàn)研究時間為2016年9～11月。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組、藥物干預(yù)方法及模型制備? 40只SD大鼠用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組（S組）、模型組（IR組）、黃連素組（H組）和黃連素+Exendin-（9-39）組（HE組），每組各10只。S組、IR組給予生理鹽水2 mL/d，連續(xù)7 d腹腔注射，S組行假手術(shù)處理，H組給予黃連素0.4 mg/（kg·d）（0.4 mg黃連素粉溶解于2 mL生理鹽水）連續(xù)7 d腹腔注射，HE組給予黃連素0.4 mg/（kg·d）（0.4 mg黃連素粉溶解于2 mL生理鹽水）腹腔注射7 d+Exendin-（9-39）45 μg/kg/3 d腹腔注射（在第1、4天注射），IR組、H組、HE組在連續(xù)注射7 d后制作大鼠腎臟缺血再灌注模型。首先對大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉，大鼠以仰臥位固定至手術(shù)臺，四肢固定，用醫(yī)用酒精進(jìn)行腹部消毒，從腹部正中線切口暴露左腎和右腎，分離出腎包膜及腎動靜脈，使腎蒂游離，切除右側(cè)腎，IR組、H組、HE組使用無損傷動脈夾夾閉左腎腎蒂，此時，腎臟顏色變?yōu)榘导t色說明腎臟血流被阻斷，45 min后松開動脈夾使血流恢復(fù)供應(yīng)，腎臟顏色變?yōu)轷r紅色，即認(rèn)為IR模型制備成功。S組在切除右腎后，僅使左側(cè)腎蒂游離，而不阻斷血流，暴露45 min后，逐層關(guān)閉腹腔。

1.2.2 血清BUN、SCr、IL-10、VEGF水平測定? 制備模型前，每組大鼠經(jīng)頸靜脈竇取血2 mL，以測大鼠血清造模前BUN、SCr、IL-10、VEGF水平，在制備模型處理或假手術(shù)處理12 h和24 h后，麻醉大鼠，經(jīng)心臟取血4 mL，每次取血后離心留取血清，依照BUN、SCr試劑盒（南京建成生物工程研究所）的操作說明，經(jīng)日本Olympus Au2700 全自動生化分析儀檢測各時間點(diǎn)血清BUN、SCr水平。按照ELISA實(shí)驗(yàn)操作及VEGF、IL-10試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）說明測定12 h和24 h時間點(diǎn)血清中VEGF、IL-10的水平。

1.2.3 腎組織學(xué)觀察及腎組織炎癥因子測定? 各組大鼠取血后，切取左側(cè)腎臟，固定采用4%多聚甲醛，制備石蠟切片，用蘇木素-伊紅（HE）染色，置于日本Olympus顯微鏡下（×200）觀察病理變化。部分剩余腎臟組織稱量，切碎，以1：10的比例加入生理鹽水，進(jìn)行勻漿，在4500 r/min、4℃條件下離心15 min，取上清液，按照ELISA實(shí)驗(yàn)操作及IL-6、IL-1β、TNF-α試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）說明測定腎組織中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能檢測結(jié)果

S組大鼠血清BUN、SCr水平在造模前、造模后12 h和24 h時間點(diǎn)無明顯差異，在造模成功12 h和24 h后，IR組、H組及HE組血清BUN、SCr水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且IR組大鼠血清BUN、SCr水平升高最為明顯。在造模成功12 h及24 h后IR組、H組及HE組血清BUN、SCr水平高于造模前及S組血清水平（P<0.05），H組及HE組BUN、SCr水平明顯比IR組低（P<0.05），造模24 h后HE組血清BUN、SCr濃度較H組低（P<0.05），見表1。

2.2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化

HE染色后，顯微鏡下（×200）可看到S組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，清晰可見，管腔無堵塞，無明顯組織形態(tài)異常。IR組腎小管可看到上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹、壞死，刷狀緣大量脫落，部分腎小管發(fā)生管型及管腔阻塞，有大量中性粒細(xì)胞浸潤腎間質(zhì)。與IR組比較，用藥組腎小管腫脹稍輕，病變程度有所減緩，腎小管刷狀緣可見少量脫落細(xì)胞，腎小管基底膜完整性較好，腎小管中管型少見。與H組比較，HE組改善程度較好，腎小管腫脹較輕，腎間質(zhì)未見明顯中性粒細(xì)胞，腎小管刷狀緣未見明顯脫落（封三圖1）。

2.3 ELISA檢測IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10結(jié)果

IL-6、IL-1β、TNF-α對腎臟缺血再灌注損傷有損害作用，IL-10對腎臟缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用，四種細(xì)胞因子在腎臟缺血再灌注損傷后均可能出現(xiàn)升高情況。結(jié)果顯示，在造模成功12 h和24 h后，IR組、H組及HE組血清IL-10含量水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且用藥組大鼠血清IL-10水平升高最為明顯（表2）。IR組、H組、HE組腎組織勻漿的IL-6、TNF-α水平均高于S組（P<0.05），其中IR組腎組織IL-6、TNF-α濃度最高（P<0.05）。與H組相比，HE組IL-6、TNF-α水平均明顯降低（P<0.05，表2）。IR組、H組、HE組血清中的IL-10水平均高于S組（P<0.05）。與S組比較，IR組、H組、HE組小鼠腎組織勻漿IL-1β水平無明顯變化（P>0.05）（表2）。

2.4 ELISA檢測血清VEGF結(jié)果

IR組、H組、HE組術(shù)后12 h和24 h血清VEGF的表達(dá)均高于相同時間點(diǎn)的S組（P<0.05）;在相同時段內(nèi)，H組、HE組血清VEGF的表達(dá)低于IR組（P<0.05），見表3。

3 討論

有研究表明[12]，腎小球?yàn)V過率作用減弱與腎小球、腎小管的變化伴隨間質(zhì)性炎癥有關(guān)，腎臟缺血再灌注可以通過降低微小血管的血流量、誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、引起白細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致急性腎損傷。在臨床研究中，腎臟缺血再灌注損傷好發(fā)于冠脈搭橋、心臟體外大循環(huán)、腎移植等手術(shù)，可導(dǎo)致大量腎單位嚴(yán)重的破壞，如大量腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、受損現(xiàn)象，腎小管刷狀緣大量脫落，空泡大量變性、壞死，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變，致使腎小球?yàn)V過率急劇下降，腎小管重吸收功能減弱，引起血清BUN、SCr增高等。本研究結(jié)果顯示，IR組血清BUN、SCr濃度較S組明顯升高，顯微鏡下觀察IR組腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯異常，小管管腔顯著腫脹、壞死，損傷嚴(yán)重部位腎小管阻塞，刷狀緣大量脫落，腎間質(zhì)出現(xiàn)充血性水腫，腎組織受到大量中性粒細(xì)胞浸潤等病理改變。這些病理特征提示IR模型建立成功。黃連素是一類常見的異喹啉類生物堿，有研究表明[13]該藥物治療消化系統(tǒng)疾病與腹瀉有著較好的療效，但是通過口服給藥吸收不理想，在體內(nèi)首過效應(yīng)較強(qiáng)，血藥濃度持續(xù)時間短，因此本研究采用腹腔注射給藥方式。Exendin-（9-39）是一種天然的胰高血糖素樣肽-1天然拮抗劑，有研究表明[14-16]Exendin-（9-39）可以促進(jìn)胃腸蠕動，增強(qiáng)胃腸的吸收功能。本研究結(jié)果證實(shí)，黃連素+ Exendin-（9-39）組（HE組）、黃連素組（H組）腎臟組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)與模型組（IR組）相比較為緩解，提示該藥物可減弱腎臟缺血再灌注損傷，緩解受損程度; 與黃連素組相比，黃連素+Exendin-（9-39）組對腎臟缺血再灌注損傷病理學(xué)變化明顯改善，提示黃連素應(yīng)用時，可適當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用Exendin-（9-39），可增強(qiáng)機(jī)體對黃連素的吸收，增加藥效，但本實(shí)驗(yàn)尚缺乏對黃連素聯(lián)合Exendin-（9-39）用藥機(jī)制，聯(lián)合用藥有待進(jìn)一步研究。與IR組相比，黃連素腹腔注射給藥干預(yù)大鼠能明顯降低血清BUN、SCr含量，血清BUN、SCr含量水平是腎臟缺血再灌注損傷后發(fā)生變化的重要指標(biāo)，H組、HE組BUN、SCr含量較低也表明黃連素能減輕腎臟缺血再灌注對大鼠造成的損傷，因此黃連素對IR大鼠有明顯的保護(hù)作用，但黃連素對IR大鼠有保護(hù)機(jī)制目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道[17-19]，有待進(jìn)一步研究。

研究表明[20-22]，當(dāng)發(fā)生缺血再灌注損傷時，涉及鈣超載、氧自由基產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞反應(yīng)，在此過程中會有眾多免疫因子和炎癥介質(zhì)的參與，而炎癥反應(yīng)參與了組織損傷的整個過程。在腎臟缺血再灌注損傷時，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，大量釋放促炎細(xì)胞因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)升高、血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞黏附、白細(xì)胞被激活及對組織造成損傷作用[23]。在炎癥反應(yīng)的過程中，巨噬細(xì)胞則發(fā)揮重要作用，它既發(fā)揮效應(yīng)細(xì)胞功能，同時也發(fā)揮抗原遞呈細(xì)胞的作用。巨噬細(xì)胞被活化后，吞噬病原體并釋放多種重要的炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α。正常情況下，巨噬細(xì)胞駐守腎臟中的數(shù)量較少，但在腎臟缺血后即出現(xiàn)快速聚集現(xiàn)象。近年來大量研究證實(shí)[24-28]由炎癥細(xì)胞以及炎癥因子介導(dǎo)的相關(guān)炎癥反應(yīng)在IR的發(fā)病中起重要作用，腎臟缺血再灌注時，大量巨噬細(xì)胞隨著血流灌注融入腎組織，在腎組織中分泌細(xì)胞因子，致使白細(xì)胞被激活，并匯聚中性粒細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使炎癥反應(yīng)瀑布樣激活，進(jìn)一步加重腎臟損傷。在炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中，IL-6、IL-1β、TNF-α是重要的促炎細(xì)胞因子，TNF-α通過上調(diào)血管內(nèi)皮黏附因子表達(dá)，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏連，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞滲出、遷徙，致使機(jī)體組織微循環(huán)受阻，造成損傷;IL-6和IL-1β可促進(jìn)粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及中性粒細(xì)胞激活，進(jìn)而加重腎臟損傷程度。而IL-10對腎臟缺血再灌注損傷主要發(fā)揮保護(hù)作用。因此，研究TNF-α、IL-6、IL-10和IL-1β等炎癥因子表達(dá)水平對大鼠腎臟缺血再灌注損傷機(jī)制具有重要的作用[29]。本課題研究顯示，與S組比較，IR組、H組、HE組血清炎癥因子IL-10及腎組織IL-6、TNF-α水平均明顯升高，表明在大鼠腎臟缺血再灌注導(dǎo)致的腎組織損傷中，機(jī)體炎癥反應(yīng)被激活，抑炎因子和促炎因子水平均升高。此外，本研究結(jié)果顯示用黃連素對大鼠進(jìn)行腹腔注射處理可明顯降低腎臟缺血再灌注損傷中促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平，提高抑炎細(xì)胞因子IL-10水平，表明黃連素預(yù)處理減輕腎臟缺血再灌注損傷可能與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。與H組相比，HE組IL-6、TNF-α水平均明顯降低，因此可認(rèn)為黃連素對細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平的分泌作用可能有劑量依賴關(guān)系，但S組、IR組、H組、HE組小鼠腎組織勻漿IL-1β水平無明顯變化，可以認(rèn)為黃連素與細(xì)胞因子IL-1β水平的分泌作用可能不相關(guān)。但黃連素在腎臟再灌注損傷抑制炎癥的具體機(jī)制不清，有待進(jìn)一步研究。

大鼠缺血再灌注損傷后，有多種細(xì)胞因子參與機(jī)體病理生理反應(yīng)，除炎癥因子IL-6、TNF-α等參與外，血管內(nèi)皮生長因子也是重要的一種[30，31]。VEGF是一種促內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，其主要作用為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂，增殖血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)血管新生，新生血管數(shù)目和血管密度與VEGF密切相關(guān)。血管新生中重要環(huán)節(jié)的發(fā)生，如血管形成、細(xì)胞移行、內(nèi)膜修復(fù)并維持其完整性等，均受VEGF影響。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟缺血再灌注損傷后，血清中VEGF明顯升高，因此，VEGF對腎臟缺血再灌注損傷的診斷和治療有一定的參考價值;用黃連素對大鼠進(jìn)行腹腔注射處理可明顯降低腎臟缺血再灌注損傷中VEGF表達(dá)水平，表明黃連素預(yù)處理減輕腎臟缺血再灌注損傷還可能與降低VEGF的表達(dá)相關(guān)。由于VEGF表達(dá)的相關(guān)信號通路較為復(fù)雜，因此黃連素預(yù)處理在腎臟缺血再灌注損傷中降低VEGF表達(dá)的具體機(jī)制尚不明確，有待深入研究。

綜上所述，黃連素后處理可減輕腎臟IR損傷，改善腎臟功能、減緩腎組織的損傷程度，抑制炎癥應(yīng)激反應(yīng)可能是其作用機(jī)制之一，但由于腎臟IR損傷發(fā)生機(jī)制、該藥物的作用機(jī)制的復(fù)雜性，黃連素保護(hù)作用與腎臟IR損傷的確切關(guān)系有待更進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-05-31）