HPLC測(cè)定兒童化妝品中10種鄰苯二甲酸酯類化合物的含量

楊永超，閆 婧，趙好力寶，李學(xué)洋，張 園，周 磊

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津 300308）

鄰苯二甲酸酯（PAEs）為鄰苯二甲酸的酯化衍生物，由于其良好性能和成本低廉，被廣泛用于食品包裝袋、玩具、紡織品和醫(yī)療設(shè)備等產(chǎn)品中［1-4］，同時(shí)，作為塑型劑和定香劑也被廣泛添加于化妝品中［5,6］，如香水、指甲油、頭發(fā)噴霧劑、洗滌用品等，可增加護(hù)膚品柔順感，降低指甲油脆性，減少香氣成分的過度揮發(fā)，用在發(fā)膠中可避免頭發(fā)僵硬等。研究［7-9］表明，PAEs可干擾人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，其毒性是三聚氰胺的20倍。PAEs已被列為主要的環(huán)境雌激素，是世界上最廣泛存在的污染物之一。人類與化妝品接觸的親密程度僅次于食品，PAEs通過與人類臉部、頭發(fā)、四肢等皮膚接觸直接被吸收，長期接觸會(huì)在人體殘留并帶來相應(yīng)的危害［10,11］。鑒于PAEs的危害，各國及組織陸續(xù)出臺(tái)相應(yīng)政策法規(guī)和限量規(guī)定。化妝品方面，美國商品標(biāo)簽法案明確要求，若化妝品中添加了PAEs必須在標(biāo)簽中明確標(biāo)出。歐盟的化妝品指令EC No.1223/2009和我國的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）（以下簡稱《規(guī)范》）［12］都禁止在化妝品中使用該類物質(zhì)。然而，現(xiàn)有法規(guī)僅僅涉及到了7種PAEs，盡管常用的鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）被禁止使用，但是其他PAEs，例如鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）則沒有使用限制，而且有文獻(xiàn)［13-15］報(bào)道其檢出率較高。

目前對(duì)PAEs主要采用氣相色譜（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜（HPLC）和液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）等手段進(jìn)行檢測(cè)［13-20］，但是相對(duì)而言，GC-MS和LC-MS造價(jià)較高，實(shí)驗(yàn)室普及率較低。GC法和HPLC法相比較，HPLC法更穩(wěn)定，分析靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都更好，故實(shí)驗(yàn)采用低成本的HPLC檢測(cè)技術(shù)。相比較于成人而言，兒童更容易吸收PAEs物質(zhì)，也更易受到傷害，因此，建立兒童化妝品中PAEs檢測(cè)方法，對(duì)保護(hù)兒童健康具有重大意義?；诖?，本文以高效液相色譜-二極管陣列（HPLCDAD）為檢測(cè)儀器，建立同時(shí)測(cè)定兒童化妝品中10種PAEs化合物含量的方法。相比于《規(guī)范》收錄的檢測(cè)方法，該方法對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化，極大的提高了10種PAEs的分離度。同時(shí)HPLC法容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，方法采用全波長掃描（190～800 nm）、加標(biāo)對(duì)照和改變流動(dòng)相的方式對(duì)疑似陽性樣品進(jìn)行確證，3種確證方式聯(lián)合使用，可替代成本較高的MS類檢測(cè)器的使用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

10種PAEs分別為鄰苯二甲酸二甲酯（DMP，CAS No.131-11-3）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP，CAS No.84-66-2）、鄰苯二甲酸二正丙酯（DPP，CAS No.131-16-8）、鄰苯二甲酸丁基芐酯（BBP，CAS No.84-74-2）、鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP，CAS No.131-18-0）、鄰苯二甲酸二正戊酯（DAP，CAS No.84-75-3）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP，CAS No.85-68-7）、鄰苯二甲酸二正己酯（DHP，CAS No.84-61-7）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP，CAS No.117-84-0）和鄰苯二甲酸二正辛酯（DOP，CAS No.117-81-7），均購自德國Dr.Ehrensorfer公司；甲醇，色譜純，美國Grace公司。

Ultimate 3000SD高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（DAD），美國Thermo Fisher公司；S 30H型超聲波清洗機(jī)，德國Elma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC條件

色譜柱：AcclaimTM120-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速為1 mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長：280 nm；進(jìn)樣體積5.0 μL。流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

表 1 梯度洗脫程序表Tab.1 The details of stepwise mobile phase gradient elution

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

分別準(zhǔn)確稱取上述10種PAEs 10 mg （精確至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；每種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別移取1.0 mL至10 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為100 mg/L的10種PAEs的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.3 樣品制備

油狀樣品處理：稱取樣品1 g （精確至0.001 g）于10 mL具塞刻度管中，加入正己烷至刻度，混勻，超聲提取20 min，每5 min晃動(dòng)一下，5 000 r/min離心5 min。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測(cè)溶液備用。

非油狀樣品處理：稱取樣品1 g （精確至0.001 g）于10 mL具塞刻度管中，加入甲醇至刻度，混勻，超聲提取20 min，每5 min晃動(dòng)一下，5 000 r/min離心5 min。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測(cè)溶液備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

考察了甲醇、正己烷、乙腈的萃取效率。實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于油狀樣品，正己烷的萃取效率更高，而對(duì)于非油狀樣品，甲醇的萃取效率更高，因此，對(duì)于油狀樣品，選用正己烷為提取劑，對(duì)于非油狀樣品，則選用甲醇為提取劑。

2.2 萃取時(shí)間的選擇

考察了萃取時(shí)間（5，10，15，20和25 min）對(duì)4大類化妝品樣品中BBP的萃取效率的影響。對(duì)于油狀樣品，5～20 min萃取效率逐步提升，20 min基本提取完全；對(duì)于非油狀樣品，15 min后，提取效率無變化。為保證達(dá)到最大提取效率，萃取時(shí)間定為20 min。

2.3 流動(dòng)相的選擇

考察了不同流動(dòng)相的分離效果（圖1）。圖1a采用《規(guī)范》中收錄的方法，流動(dòng)相是甲醇和水，化合物4和5，6和7的分離度較低，基線也不平穩(wěn)。圖1b流動(dòng)相為甲醇、水、乙腈，大大改善化合物4和5，6和7的分離度，并且基線也更平穩(wěn)，因此，選擇甲醇、水、乙腈組成的三元流動(dòng)相。

2.4 線性范圍

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以甲醇稀釋，得到10種PAEs質(zhì)量濃度均為1，5，10，25，50和100 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。上機(jī)測(cè)試，記錄10種PAEs化合物的峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)測(cè)試3次，取平均值。以質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得到的回歸方程如表2所示。結(jié)果顯示，10種PAEs在1～100 mg/L范圍內(nèi)線性良好。

表 2 10種PAEs在1～100 mg/L范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Li near regression equations and correlation coefficients for 10 PAEs in the level range of 1-100 mg/L

2.5 檢出限、定量限和檢出濃度、最低定量濃度

采用逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液方法進(jìn)樣，信噪比（S/N）為3時(shí)的樣品濃度即為檢出限；S/N為10時(shí)的樣品濃度即為定量限。本方法10種PAEs的檢出限、定量限以及檢出濃度、最低定量濃度（取樣量為1.0 g，定容體積為10 mL）見表3。

表 3 各組分的檢出限、定量限、檢出濃度和最低定量濃度Tab.3 The LOD， LOQ， lowest detective and quantitative concentrations for 10 PAEs

2.6 回收率和精密度

分別稱取3種陰性化妝品樣品（水狀、霜乳狀、油狀）各6份（n=6），每份添加2.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L），即標(biāo)準(zhǔn)品添加量為200 μg，按照“1.2.3”項(xiàng)下的方法制備樣品（定容至10 mL，即質(zhì)量濃度為20 mg/L），上機(jī)測(cè)試，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10種PAEs的添加回收率在89.2%～106.1%之間，表明加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。測(cè)定結(jié)果的RSD均小于5%，該方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表 4 10種PAEs的添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Recovery results of 10 PAEs （n=6）

2.7 樣品檢測(cè)

2.7.1 市售樣品檢測(cè)

取市售8種化妝品樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下的方法制備樣品上機(jī)測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如表5所示，8種樣品中2#樣品檢出DEHP，含量為6 573.6 μg/g，證明市場上化妝品確實(shí)存在風(fēng)險(xiǎn)。

表 5 8種樣品檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Test results of 8 commercial samples

2.7.2 陽性樣品確證

1）圖譜對(duì)照：數(shù)據(jù)采集過程中采用全掃描方式（190～800 nm），提取2#樣品中檢出物質(zhì)DEHP的紫外圖譜和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DEHP的紫外圖譜進(jìn)行對(duì)比，見圖2（見下頁）。二者的紫外吸收?qǐng)D譜基本一致，因此，判斷2#樣品為陽性。

2）加標(biāo)對(duì)照：采取了加標(biāo)對(duì)照的方式，驗(yàn)證2#樣品為陽性。詳見圖3a和圖3b（見下頁），其中曲線a為2#樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋；曲線b為稀釋后的2#樣品溶液加入同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。由圖3中可見，曲線a和b的出峰完全重合，且加標(biāo)后樣品的峰面積基本為加標(biāo)前的2倍，因此，進(jìn)一步推斷2#樣品為陽性樣品。

3）改變流動(dòng)相：為進(jìn)一步驗(yàn)證陽性樣品的準(zhǔn)確性，采取了加大流動(dòng)相的極性，詳見圖3c和圖3d（見下頁），其中曲線c為DEHP的標(biāo)準(zhǔn)溶液；曲線d為稀釋后的2#樣品溶液加入同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。流動(dòng)相極性改變后，曲線c和d的出峰時(shí)間一致，并且曲線d沒有出現(xiàn)峰分裂的現(xiàn)象，證明2#樣品中檢出物質(zhì)與添加的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為同一物質(zhì)，證明2#樣品為陽性。

3 結(jié)論

建立了測(cè)定兒童化妝品中10種PAEs的HPLC-DAD方法。該方法線性范圍廣，精密度良好，靈敏度高，可滿足化妝品檢測(cè)要求。該方法應(yīng)用于市售8種化妝品的檢測(cè)，并通過紫外圖譜比對(duì)、加標(biāo)實(shí)驗(yàn)以及改變流動(dòng)相3種方式對(duì)陽性樣品進(jìn)行了確證，結(jié)果表明確實(shí)為陽性樣品，這也表明我國化妝品市場上風(fēng)險(xiǎn)是存在的，化妝品市場監(jiān)管有待加強(qiáng)。