黃柏鹽的制備及其抗氧化抗菌性能研究

高天成 ，孫 權(quán)，唐 娜 ，楊亞茹

（1.天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津 300457；2.天津海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；

3.天津長(zhǎng)蘆海晶集團(tuán)有限公司，天津 300457；4.天津科技大學(xué) 食品生物技術(shù)教育部工程研究中心，天津 300457）

鹽是人類日常生活的必需品，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于鹽產(chǎn)品的多角度開(kāi)發(fā)取得了一定進(jìn)展。在食品領(lǐng)域，多品種鹽主要包括竹鹽、菇鹽、海藻鹽等，多品種食用鹽滿足了不同消費(fèi)群體對(duì)食鹽市場(chǎng)高、中、低端的各種需求；在化妝品領(lǐng)域，各種美容、護(hù)膚、潔面鹽也在逐步受到廣大消費(fèi)者的青睞。然而，絕大部分多品種鹽以精制鹽作為載體，卻忽略了富含多種礦物質(zhì)元素的海鹽［1］。隨著人們對(duì)安全隱患的重視，純天然護(hù)膚品深受消費(fèi)者的青睞，因此開(kāi)發(fā)純天然的護(hù)膚美容鹽成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

黃柏為蕓香科植物黃檗的干燥樹(shù)皮，來(lái)源廣泛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃柏具有抗菌、消炎、抗衰老、抗癌等藥理作用，黃柏藥理作用的活性成分主要包括總生物堿、小劈堿、黃柏堿、多酚化合物以及類黃酮等［2］。安健等［3］從黃柏中提取出鹽酸小劈堿，并對(duì)其抗菌性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明黃柏提取成分鹽酸小劈堿對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌均具有較好的抗菌性能，抑菌率達(dá)到70%以上。李慎新等［4］研究了黃柏、連翹等5種中藥植物的抗氧化活性，結(jié)果表明黃柏的乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，主要是黃柏中黃酮類化合物及酚類化合物等活性成分發(fā)揮抗氧化作用。根據(jù)《雷公炮炙論》記載：“中藥經(jīng)鹽制后，具有增強(qiáng)補(bǔ)肝腎、潤(rùn)下利水、滋陰降火的作用，可緩和中藥的辛燥之性?！北狙芯恳詢?yōu)質(zhì)日曬海鹽為載體，配以天然中草藥黃柏的有效成分制備黃柏美容鹽，對(duì)其抗氧化性、抗菌性等功效進(jìn)行研究，為今后植物鹽護(hù)膚品的多角度開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

黃柏，貴州云峰藥業(yè)有限公司；日曬海鹽，天津長(zhǎng)蘆漢沽鹽場(chǎng)公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、三羥甲基氨基甲烷，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；蘆丁、沒(méi)食子酸、福林酚、左旋多巴、L-酪氨酸、N-琥珀酰-L-三丙氯酸-對(duì)硝基苯胺、酪氨酸酶、彈性蛋白酶、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

S220型pH計(jì)，美國(guó)梅特勒-托利多公司；SPECORD 210 PLUS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，德國(guó)耶拿分析儀器公司；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃柏鹽的制備

以日曬海鹽為基料，配以天然中草藥植物（黃柏）提取液，制備黃柏美容鹽。首先，稱取10 g片狀的黃柏（干燥）放入1 L乙醇（75%）中浸泡，放置于75 ℃的水浴恒溫振蕩器中振蕩2 h，靜置24 h后進(jìn)行過(guò)濾處理，制得質(zhì)量濃度為0.677 g/L的黃柏提取液。然后，將日曬海鹽溶解后真空抽濾，濾液經(jīng)過(guò)加熱后蒸發(fā)結(jié)晶，制備重結(jié)晶鹽。最后，量取一定體積0.677 g/L的黃柏提取液與一定質(zhì)量的重結(jié)晶鹽混合均勻，混合液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中經(jīng)過(guò)減壓蒸餾后，即可實(shí)現(xiàn)乙醇的回收，剩余的淡黃色晶體即黃柏鹽。

1.2.2 黃柏鹽中離子檢測(cè)

Ca2+、Mg2+采用EDTA絡(luò)合滴定法測(cè)定，Cl-采用硝酸銀容量法測(cè)定，K+采用原子吸收光譜法測(cè)定。

1.2.3 黃柏鹽中多酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法［5］測(cè)定黃柏鹽樣品中多酚的含量。量取質(zhì)量濃度為100 mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30和0.35 mL于10 mL比色管中，加蒸餾水定容至2 mL，搖勻后加1.0 mL福林酚，4 min后加入1.0 mL 10%的碳酸鈉溶液，25 ℃水浴條件下保持2 h，測(cè)定溶液在765 nm處的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.060 4x+0.049 7。樣品測(cè)定同法操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃柏鹽中多酚含量。

1.2.4 黃柏鹽中類黃酮含量測(cè)定

采用三氯化鋁法［6］測(cè)定黃柏鹽樣品中類黃酮的含量。分別吸取質(zhì)量濃度為100 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL于25 mL比色管中，分別加入1.5%的AlCl3溶液8 mL，pH=5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液4 mL，并加入50%乙醇定容到25 mL，靜置30 min。以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為空白對(duì)照，測(cè)定溶液在415 nm處的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，顯色液中蘆丁的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.007x+0.109。樣品測(cè)定同法操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃柏鹽中類黃酮含量。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

吸取0.1 mL黃柏鹽樣品溶液置于5 mL試管中，加入0.9 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，室溫下避光放置10 min后于517 nm處測(cè)定樣品的吸光值A(chǔ)1；同法操作，用等體積蒸餾水代替黃柏鹽樣品溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)0；用等體積無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)2，用以扣除樣品本身對(duì)吸光度測(cè)定的干擾。DPPH自由基清除率=［1-（A1-A2）/A0］×100%。

1.2.6 酪氨酸酶抑制活性實(shí)驗(yàn)［7］

吸取1.9 mL黃柏鹽樣品溶液置于10 mL試管中，加入1 mL 0.03% L-酪氨酸溶液，置于37 ℃的恒溫水浴中保溫10 min后加入0.1 mL酪氨酸酶溶液反應(yīng)2 min，于475 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)t；同法操作，用等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酪氨酸酶溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)1；用等體積蒸餾水代替黃柏鹽樣品溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)b；用等體積蒸餾水代替黃柏鹽樣品溶液，用等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酪氨酸酶溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)0。酪氨酸酶活性抑制率=［1-（At-Al）/（Ab-A0）］×100%。

1.2.7 抗菌性實(shí)驗(yàn)

采用藥物平板稀釋法［8］，配制不同濃度的黃柏鹽樣品平板，在每個(gè)平皿中貼上浸有菌懸液的濾紙片（無(wú)菌操作），于37 ℃培養(yǎng)2 d，觀察測(cè)量菌落直徑。菌落直徑為3次測(cè)量的平均值，抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。抑制劑對(duì)各個(gè)生物活性抑制能力的強(qiáng)弱可采用抑制率來(lái)表達(dá)，但抑制率隨抑制劑濃度的變化而變化，直接采用抑制率比較抑制劑抑制能力的強(qiáng)弱不夠準(zhǔn)確。目前通常采用抑制率達(dá)到50%時(shí)的抑制劑濃度（IC50）作為抑制劑抑制能力強(qiáng)弱的指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)分析

表1為黃柏鹽的理化指標(biāo)。由表1可以看出，以日曬海鹽作為對(duì)照，黃柏鹽中隨著黃柏含量的增加，含水量和不溶物質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大。黃柏鹽的pH值也隨著黃柏含量的增加而增大，且其pH接近中性，這是因?yàn)辄S柏中主要成分為小劈堿，小劈堿是一種季銨型生物堿，具有弱堿性。當(dāng)化妝品的pH值和皮膚的pH值保持一致時(shí)，化妝品才能達(dá)到清潔皮膚且不破壞皮膚原有抵抗力的效果。人體皮膚的pH值約為5.5～7.0，黃柏鹽的pH接近中性，與皮膚比較接近。

表 1 黃柏鹽的理化指標(biāo)Tab.1 Physical and chemical parameters of phellodendron beauty salt

日曬海鹽中含有許多人體必需的鈣、鎂、鉀等礦物元素。Ca2+能夠保護(hù)細(xì)胞膜不受破壞，還能使皮膚保持一定的彈性。Mg2+能夠修復(fù)經(jīng)紫外線輻射損傷的細(xì)胞，并具有防護(hù)功能。K+能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)、外液的滲透壓以及酸堿平衡，活化體內(nèi)若干種酶的活性，通過(guò)酶參與體內(nèi)蛋白質(zhì)和碳水化合物的代謝和合成。增加黃柏鹽中黃柏含量，鹽度逐漸減少，Mg2+、K+含量緩慢減小，Ca2+含量緩慢增大。

表1中4種不同配比黃柏鹽雖然各項(xiàng)理化指標(biāo)略有差異，但是均符合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）標(biāo)準(zhǔn)，可以作為植物鹽護(hù)膚品進(jìn)行開(kāi)發(fā)與利用。

2.2 生理活性分析

2.2.1 黃柏鹽中多酚和類黃酮含量分析

類黃酮屬于酚類物質(zhì)，多酚和類黃酮具有較好的生物活性，黃柏提取物的抗氧化性與其含量密切相關(guān)。表2為不同配比黃柏鹽中多酚和類黃酮的含量。由表2可以看出，黃柏鹽中隨著黃柏含量的增加，多酚含量和類黃酮含量逐漸增大。2.5%黃柏鹽中多酚含量和類黃酮含量較低，分別為0.119和0.029 mg/g；10%黃柏鹽中多酚含量和類黃酮含量較高，分別為0.256和0.181 mg/g。

表 2 不同配比黃柏鹽中多酚和類黃酮的含量Tab.2 Co ncents of polyphenols and flavonoids in different phellodendron beauty salts

2.2.2 黃柏鹽對(duì)DPPH自由基的清除作用

分別對(duì)2.5%，5%和10% 3種不同黃柏含量的黃柏鹽樣品進(jìn)行DPPH自由基清除能力測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，不同配比黃柏鹽對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除效果，且黃柏鹽中黃柏含量的高低與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)關(guān)系。3種配比黃柏鹽樣品中，2.5%黃柏鹽清除作用最弱，抑制率達(dá)到50%時(shí)的IC50為363.64 g/L；10%黃柏鹽清除作用最強(qiáng)，IC50為124.83 g/L。自由基在體內(nèi)過(guò)度累計(jì)，富集于脂質(zhì)細(xì)胞膜周圍，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，這是造成人體衰老的主要原因。該黃柏鹽中所含有的多酚和類黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠清除體內(nèi)游離的自由基，有效地阻止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的進(jìn)行，絡(luò)合金屬離子，具有延緩衰老的功效［9,10］。

2.2.3 黃柏鹽對(duì)酪氨酸酶的抑制活性

分別對(duì)2.5%，5%和10% 3種不同黃柏含量的黃柏鹽樣品進(jìn)行酪氨酸酶抑制活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，不同配比黃柏鹽對(duì)酪氨酸酶都具有一定的抑制作用，2.5%和5%黃柏鹽的抑制作用相差不大，IC50分別為304.51和254.36 g/L。隨著黃柏含量的增大，抑制效果越來(lái)越顯著，3種配比黃柏鹽樣品中，10%黃柏鹽對(duì)酪氨酸酶的抑制效果最佳，IC50為147.04 g/L。酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下會(huì)生成黑色素，過(guò)多的黑色素累積會(huì)使皮膚表面出現(xiàn)各種黑斑。黃柏鹽可以有效地抑制酪氨酸酶的活性，具有一定的祛除黑色素的功效，起到美膚效果。

2.2.4 黃柏鹽的抗菌性

分別采用2.5%，5%和10% 3種不同黃柏含量的黃柏鹽樣品，使用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，黃柏鹽對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有一定的抗菌性能，對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性優(yōu)于大腸桿菌。10%黃柏鹽對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的IC50分別為131.58和159.69 g/L。這是因?yàn)辄S柏中的小劈堿、多酚和類黃酮均具有良好的抑菌性［11］。

3 結(jié)論

1） 研究了不同配比黃柏鹽樣品的理化性質(zhì)和生理活性，最終確定黃柏鹽中的黃柏較佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。隨著黃柏質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，含水量和pH值逐漸增加，且其pH接近中性。

2） 黃柏質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)性，該樣品鹽對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為124.83 g/L。

3） 不同配比黃柏鹽對(duì)酪氨酸酶都具有一定的抑制作用，隨著黃柏質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，抑制效果越來(lái)越顯著；對(duì)酪氨酸酶的IC50為124.83 g/L。

4） 黃柏鹽對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有一定的抗菌性能，對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性優(yōu)于大腸桿菌。對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的IC50分別為131.58和159.69 g/L。