多功能載鰹魚肽海藻酸鈣微球的制備與表征

盛劍勇，肖俊勇，何家軒，孫寧澤，劉翠婷，彭天昊，馬方勵，劉衛(wèi)

活性肽是保健食品中的一類功能因子，因其來源廣泛、活性多樣而成為目前的研究熱點(diǎn)。鰹魚肽是提取自深海魚類鰹魚的多肽，具有降尿酸的作用。與提取自海產(chǎn)品的魚油、明膠等一樣，鰹魚肽具有強(qiáng)烈的腥味，消費(fèi)者直接服用的體驗(yàn)較差。多肽的主要吸收部位是小腸，在胃中吸收往往較差[1]。但是，胃內(nèi)酸環(huán)境和消化酶易使活性多肽發(fā)生降解，從而減弱其功效。此外，鰹魚肽原料粉末通過噴霧干燥工藝制備所得，與噴霧干燥制得的中藥浸膏粉一樣具有吸濕性較強(qiáng)的特點(diǎn)，不利于后續(xù)制劑工藝的進(jìn)行[2]。因此，鰹魚肽的制劑需要彌補(bǔ)原料的缺點(diǎn)，提高顧客體驗(yàn)感，在保持鰹魚肽活性的同時促進(jìn)吸收，降低濕性。

大多數(shù)蛋白、多肽類保健食品功能因子的單次服用量大，因此通常被開發(fā)成液體飲料或固體飲料[3]。液體飲料的制備工藝一般包含熱壓滅菌，經(jīng)歷高溫環(huán)境可能會降低功能因子的活性[4]。因此，沖劑等固體飲料是鰹魚肽的理想劑型。海藻酸鈣微球因其腸溶的特性和高生物安全性，已被廣泛用于藥品和保健食品的制劑[5-6]。課題組前期研究表明，海藻酸鈣微球能夠控制所載蛋白在胃中的釋放，保護(hù)蛋白不被胃酶降解，從而促進(jìn)其口服吸收[7]。我們假設(shè)產(chǎn)生異味的物質(zhì)可能與活性肽一樣也分散于海藻酸鈣的凝膠網(wǎng)絡(luò)中，從而減緩釋放，達(dá)到掩味的效果。此外，將鰹魚肽粉末制備成微球后，能夠有效降低粉體的比表面積，從而降低吸濕性。綜上，海藻酸鈣微球有望同時彌補(bǔ)鰹魚肽原料的缺點(diǎn)，有望成為理想的鰹魚肽制劑中間體。

本研究擬通過微膠囊造粒儀制備載鰹魚肽海藻酸鈣微球。通過吸濕增重對微球的防潮性能進(jìn)行評價；通過在模擬胃腸液中多肽的釋放對鰹魚肽的吸收進(jìn)行預(yù)測；通過頂空進(jìn)樣氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)確定鰹魚肽原料中異味物質(zhì)的指標(biāo)性成分，依此檢測載鰹魚肽海藻酸鈣微球在沖泡后異味物質(zhì)的釋放程度，對其掩味效果進(jìn)行評價。

本研究起止時間為2016年3月至2017年8月。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1原料和儀器設(shè)備海藻酸鈉(青島雙成有限公司，食品級，粘度300 cp.s)，鰹魚肽(無限極(中國)有限公司，食品級)，BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，微膠囊造粒儀(瑞士Buchi公司，B-390)，顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司，LEICA DM 3000 LED)，凱氏定氮儀(上海洪記儀器設(shè)備有限公司，ATN-300)，冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，F(xiàn)D-1A-50)，溶出試驗(yàn)儀(天大天發(fā)科技有限公司，RC12AD)，氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司，5975)。

1.2載鰹魚肽海藻酸鈣微球的制備參照文獻(xiàn)報道，對海藻酸鈣微球的制備工藝進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，以適用于微膠囊造粒儀[8]。配制1.5% (W/V)濃度的海藻酸鈉溶液，加入適量鰹魚肽粉末，溶解，使鰹魚肽與海藻酸鈉的質(zhì)量比為2∶1。通過氮?dú)饧訅簩Ⅵ烎~肽和海藻酸鈉的混合溶液泵入微膠囊造粒儀，載氣壓力為450 mbar，此時流速約為10 mL/min。當(dāng)混合溶液流經(jīng)300 μm孔徑的噴嘴時，在噴嘴上施加振動，使混合溶液分散成小液滴，設(shè)置振動的頻率為836 Hz。小液滴通過電壓為1 000 V的電場，液滴之間因帶同種電荷而相互分散，滴入1.5% (W/V)的氯化鈣溶液中。邊滴加邊攪拌接收液。待滴加完成后，繼續(xù)攪拌10 min。過濾收集微球。將所得微球在-20 ℃預(yù)凍12 h后，放入冷凍干燥儀凍干。

1.3微球的表征

1.3.1形態(tài)觀察 稱取載鰹魚肽海藻酸鈣微球適量，置于光學(xué)顯微鏡下(20×)觀察微球形態(tài)，采集圖片。

1.3.2鰹魚肽含量的測定 使用凱氏定氮法測定海藻酸鈣微球中鰹魚肽的含量。精密稱取載鰹魚肽海藻酸鈣微球質(zhì)量m1(g)，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB50095-2010的方法進(jìn)行檢測，記錄耗費(fèi)的鹽酸滴定液體積V1(mL)。精密稱取鰹魚肽原料粉末質(zhì)量m2(g)，按上法操作，記錄耗費(fèi)的鹽酸滴定液體積V2(mL)。按以下公式計算微球樣品中鰹魚肽含量：

1.4吸濕增重精密稱取適量載鰹魚肽微球或鰹魚肽原料粉末置于稱量瓶中，放入恒溫恒濕穩(wěn)定箱，置于25 ℃、相對濕度為65%的環(huán)境下，按時質(zhì)量。將各個時間點(diǎn)的質(zhì)量除以質(zhì)量的初始值，計算得到增重百分率。平行制備三份樣品，計算平均吸濕增重百分率，繪制平均吸濕增重百分率隨時間變化的曲線。

1.5鰹魚肽在模擬胃腸液中的釋放參照文獻(xiàn)分別配制pH=1.0的鹽酸溶液和pH=6.8的磷酸鹽緩沖液，分別作為模擬胃液和模擬腸液[9]。參照中國藥典2015版附錄“溶出度與釋放度測定法”考察微球中鰹魚肽在模擬胃腸液介質(zhì)中的釋放。在溶出杯中加入模擬胃液或模擬腸液900 mL，置于溶出度測定儀上，設(shè)置攪拌槳的轉(zhuǎn)速為50 r/min，預(yù)熱至37 ℃。精密稱取載鰹魚肽微球10 g，投入到溶出杯中，開始計時。分別在給定時間點(diǎn)取樣5 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，并立即補(bǔ)充空白介質(zhì)5 mL。使用鰹魚肽原料粉末作為對照，按BCA法(蛋白測定方法)檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，對續(xù)濾液中鰹魚肽的濃度進(jìn)行測定。經(jīng)過取樣校正，計算得到各個時間點(diǎn)鰹魚肽的累計釋放百分率，繪制累計釋放百分率-時間曲線。

1.6揮發(fā)性異味物質(zhì)的檢測參考文獻(xiàn)，使用頂空進(jìn)樣氣相-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對鰹魚肽原料粉末中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測[10]。將DB-WAX色譜柱(30 m × 0.25 μm × 0.25 mm)裝于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上，設(shè)置色譜柱的升溫程序如下：起始溫度70 ℃，保溫3 min，7 ℃/min升到240 ℃，保持20 min。載氣為氦氣，設(shè)置體積流量0.8 L/min，分流比10∶1。精密稱取鰹魚肽原料粉末適量，置于頂空進(jìn)樣瓶中，加入水適量，立即置于頂空進(jìn)樣模塊上，于85 ℃下保溫30 min后頂空進(jìn)樣，溫度95 ℃。MS檢測器的條件為：電離方式為EI+，電子能量70 eV，燈絲發(fā)射電流為200 μA，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍為35 ～350 m/z。檢索NIST 08和WILEY數(shù)據(jù)庫，對比質(zhì)譜圖，確定揮發(fā)性物質(zhì)的組分。

1.7揮發(fā)性異味物質(zhì)的體外釋放精密稱取載鰹魚肽微球1 g(含鰹魚肽0.19 g)置于頂空進(jìn)樣樣品瓶內(nèi)，加入水適量，立即按1.6所述GC-MS方法進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。稱取鰹魚肽原料粉末0.04 g，加入水適量，溶解，同法檢測，作為對照。對比載鰹魚肽微球和對照樣品中異味物質(zhì)的釋放量。

2 結(jié)果與討論

2.1載鰹魚肽海藻酸鈣微球的表征海藻酸鈉是提取自海藻的一類天然高分子。海藻酸鈉在氯化鈣水溶液中可發(fā)生交聯(lián)，形成海藻酸鈣凝膠。據(jù)此，向氯化鈣溶液中滴注海藻酸鈉溶液可制得海藻酸鈣微球[11]。該制備在常溫的水相中進(jìn)行，有利于活性肽的穩(wěn)定和保持活性。

然而，用傳統(tǒng)的滴注法制備海藻酸鈣微球效率低，批次之間差異性大，粒徑較難控制。本研究對海藻酸鈣微球的制備工藝進(jìn)行改進(jìn)，使用微膠囊造粒儀進(jìn)行載鰹魚肽海藻酸鈣微球的制備。海藻酸鈉和鰹魚肽的混合溶液通過氣壓瓶輸注入微膠囊造粒儀，液流在通過噴嘴時由于高頻振動生成微球狀液滴，液滴數(shù)目與同振動頻率成正比。生成的液滴在電場的作用下帶電，可通過靜電分散技術(shù)防止液滴互相粘連[12]。最后，海藻酸鈉和鰹魚肽的混合液滴滴入氯化鈣溶液中，交聯(lián)固化，得到載鰹魚肽海藻酸鈣微球。使用微膠囊造粒儀進(jìn)行制備可控性高，且易于實(shí)現(xiàn)工藝的放大。

通過微膠囊造粒儀制備的微球烘干后外形美觀、大小均一，粒徑在100 μm左右(如圖1)。

圖1 載鰹魚肽海藻酸鈣微球的顯微鏡圖(放大20倍)

保健食品的單次服用量較大，所以制劑需要有較高的功能因子含量。用凱氏定氮法測得所制備的微球中鰹魚肽的含量為18.9%。與同類研究相比，本研究所得微球的活性成分載量較高[13]，有利于滿足保健食品對功能因子含量的要求。

2.2吸濕性考察如圖2所示，鰹魚肽原料粉末在25 ℃、65%相對濕度(RH)環(huán)境下2 h的吸濕增重即達(dá)到60%左右，10 h的吸濕增重更是達(dá)到120%以上，并出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象。鰹魚肽原料粉末的吸濕嚴(yán)重，這是因?yàn)閲婌F干燥所得的鰹魚肽原料粉末較為疏松，具有較大的表面積，易于吸附空氣中的水分子。鰹魚肽原料吸濕后發(fā)生結(jié)塊，且呈半固體狀，流動性變差，難以與固體輔料混合均勻，使制粒工藝面臨極大挑戰(zhàn)。本研究所述鰹魚肽微球的制備方法中，首先將鰹魚肽原料粉末溶解在水中，再進(jìn)行后續(xù)制備過程，避免了直接使用鰹魚肽原料粉末進(jìn)行制粒。

圖2 載鰹魚肽海藻酸鈣微球和鰹魚肽粉末吸濕增重隨時間變化曲線

制備所得鰹魚肽微球在25 ℃、65%RH環(huán)境下10 h的吸濕增重僅有9.78%，顯著低于鰹魚肽原料粉末?？梢妼Ⅵ烎~肽制備成微球后，吸濕性顯著降低。這一方面是由于微球的表面積較粉末減小，另一方面是由于吸濕性較強(qiáng)的鰹魚肽粉末被海藻酸鈣所包裹，從而與空氣中的水分隔絕。本研究所制備載鰹魚肽海藻酸鈣微球的吸濕性得到了有效控制，有利于混合、填裝等制劑工藝的開展。

2.3鰹魚肽的體外釋放評價使用BCA試劑盒對0.05～0.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)的鰹魚肽溶液進(jìn)行測定，將吸光度值與鰹魚肽濃度進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.675 9C(mg/mL)+0.032 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 3，線性良好。

在模擬胃腸液中，鰹魚肽從微球中的釋放曲線如圖3所示。在模擬胃液中孵育2 h后，鰹魚肽從海藻酸鈣微球中的累計釋放百分率低于3%，說明海藻酸鈣微球能夠有效控制鰹魚肽在胃中的釋放。在模擬胃液中孵育1 h后，鰹魚肽從海藻酸鈣微球中的累計釋放百分率即大于90%，說明海藻酸鈣微球能夠在腸液中近乎完全釋放鰹魚肽。鰹魚肽從所制備的微球中的釋放行為達(dá)到了腸溶制劑的標(biāo)準(zhǔn)。該釋放特性與其他關(guān)于海藻酸鈣微球的報道相符[5,7]。

通過體外釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以對載鰹魚肽海藻酸鈣腸溶微球的體內(nèi)行為進(jìn)行預(yù)測。在口服后，該海藻酸鈣腸溶微球在胃中可能僅釋放少量的鰹魚肽，有望在生理條件嚴(yán)苛且吸收較差的胃部對鰹魚肽起到保護(hù)作用。當(dāng)該海藻酸鈣腸溶微球運(yùn)行到小腸部位時，幾乎所有的鰹魚肽快速地從微球中釋放，能夠使鰹魚肽在多肽的主要吸收部位小腸中達(dá)到較高濃度，有利于鰹魚肽的吸收。

圖3 鰹魚肽微球在模擬胃液及模擬腸液中釋放曲線

2.4揮發(fā)性異味物質(zhì)的體外釋放評價人類對于味道的實(shí)際感受受到嗅覺的影響。我們所感受到的味道是嗅覺和味覺的整合。與味覺相比，嗅覺是一種遠(yuǎn)感，是通過長距離感受化學(xué)刺激的感覺[14]。因此，嗅覺是消費(fèi)者對保健食品的第一重感受之一。掩蔽鰹魚肽原料的不良嗅味，對提高顧客體驗(yàn)非常重要。

有研究表明三甲胺、小分子醛類和酮類等是海產(chǎn)品中腥味產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。在對海藻酸鈣微球的掩味效果進(jìn)行研究之前，需要對鰹魚肽原料異味的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究。氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)融合了氣相色譜的分離與質(zhì)譜的定性檢測功能，具有靈敏度、特異性高的特點(diǎn)，是揮發(fā)性異味物質(zhì)的檢測和鑒定的常用方法[16]。在獲得氣質(zhì)分析數(shù)據(jù)后，可通過譜庫檢索對揮發(fā)性組分進(jìn)行鑒定，通過峰面積來對揮發(fā)性組分進(jìn)行定量。頂空進(jìn)樣器可通過加熱使固體、液體、半固體等無法直接進(jìn)入氣相色譜分析的樣品揮發(fā)，然后吸取其氣體進(jìn)入色譜分析。

沖劑是鰹魚肽的備選劑型之一。沖劑在服用前的熱水沖泡過程會有利于鰹魚肽中揮發(fā)性異味物質(zhì)的擴(kuò)散。因此，為了檢測熱水沖泡的過程中異味物質(zhì)的釋放，在裝有載鰹魚肽海藻酸鈣微球的頂空進(jìn)樣瓶中加入水后，設(shè)置頂空進(jìn)樣器加熱溫度為85 ℃。使用GC-MS的方法對此時的揮發(fā)性物質(zhì)成分進(jìn)行檢測，即可對沖泡過程中載鰹魚肽海藻酸鈣微球異味的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究。

使用頂空進(jìn)樣GC-MS對鰹魚肽原料中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)原料中的揮發(fā)性物質(zhì)有三甲基丁醛、二甲基丁醇、二甲基二硫醚等，這些物質(zhì)均有特別的嗅味。由于檢測到的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量較多(6種)，而所產(chǎn)生的嗅味是這些物質(zhì)共同作用的結(jié)果，所以使用面積歸一化法將各個組分的總離子強(qiáng)度進(jìn)行加和，用于表征異味的強(qiáng)弱[17]。

使用上述方法對載鰹魚肽海藻酸鈣微球中的揮發(fā)性異味成分進(jìn)行定量，并將鰹魚肽原料作為對照，按同法進(jìn)行檢測。其中，微球中鰹魚肽的量是對照組的5倍。結(jié)果如表1所示，鰹魚肽微球樣品中異味物質(zhì)的峰面積總和小于鰹魚肽原料對照組的峰面積總和。該結(jié)果表明所制備的鰹魚肽微球在高溫下釋放出揮發(fā)性異味物質(zhì)的量低于總量的20%，預(yù)示該海藻酸鈣微球在沖泡過程中可掩蓋80%的異味。

通過將鰹魚肽原料制備成海藻酸鈣微球已經(jīng)可以對不良?xì)馕镀鸬接行У难谏w。在后續(xù)制劑的制備過程中，還可以通過加入矯味劑和一些其他掩味策略的聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步提高鰹魚肽產(chǎn)品的顧客體驗(yàn)感。

表1 GC-MS檢測鰹魚肽原料和微球中揮發(fā)性成分所得峰面積

3 結(jié)論

本研究通過微膠囊造粒儀制備得到了載鰹魚肽海藻酸鈣微球，外觀圓整，粒徑分布均一。其吸濕性較鰹魚肽原料顯著降低，有利于后續(xù)制劑工藝的進(jìn)行和長期儲存。所制備的載鰹魚肽海藻酸鈣微球具有腸溶特性，預(yù)測在口服后能夠在胃中保護(hù)所包載鰹魚肽的活性，在小腸中能夠形成較高的鰹魚肽濃度，從而有利于吸收。通過頂空進(jìn)樣GC-MS對揮發(fā)性異味物質(zhì)分析，所制備的海藻酸鈣微球可在沖泡過程中掩蓋80%的異味。本研究通過將鰹魚肽原料粉末制備成海藻酸鈣微球，解決了原料吸濕性強(qiáng)、在胃中易失活和感官刺激大的缺點(diǎn)，為后續(xù)制劑工藝提供了較好的制劑中間體，也為海洋來源活性肽保健食品制劑的開發(fā)提供了新的思路。