種子類藥材菟絲子提取工藝研究

夏宇成，張?zhí)m，陳宇潔，鞠建明，史艷玲

種子類藥材菟絲子為旋花科植物菟絲子(CuscutachinensisLam.)或南方菟絲子(CuscutaaustralisR.Br.)的干燥成熟種子，具有補(bǔ)益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉的功效[1]309。菟絲子作為臨床上一種常用的中藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國(guó)產(chǎn)地分布廣泛，主產(chǎn)于山東、河北、山西、陜西、江蘇、黑龍江、吉林、新疆等地，其化學(xué)成分主要包括黃酮類、多糖類、生物堿類、萜類、甾體類、揮發(fā)油以及木質(zhì)素等化合物[2]，其中金絲桃苷、槲皮素、紫云英甙等黃酮類成分為其主要活性成分[3-4]。

圖1 金絲桃苷高效液相色譜圖：A為金絲桃苷對(duì)照品；B為供試樣品

菟絲子粒度細(xì)小，在實(shí)際煎煮過程中通常采用包煎的方式。但是課題組在研究其提取方法的時(shí)候發(fā)現(xiàn)該藥材包煎或不包煎，水提或醇提其主要活性成分金絲桃苷提取率均較低。分析原因，推測(cè)可能因?yàn)檩私z子種皮致密，提取溶劑不易滲透進(jìn)入種子內(nèi)部，有效成分難以提取出來。文獻(xiàn)報(bào)道菟絲子的提取方法有響應(yīng)面法提取多糖[5]，正交試驗(yàn)酶法提取金絲桃苷[6]，正交試驗(yàn)提取總黃酮[7]等方法，但均沒有考慮菟絲子種皮致密，溶劑不易穿透進(jìn)入的因素。鑒于王不留行、萊菔子等質(zhì)地類似的種子類藥材需要炒至爆開白花或炒至鼓起，用時(shí)搗碎的處理方法[1]53，272，本實(shí)驗(yàn)擬以金絲桃苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素平行比較法對(duì)菟絲子提取前處理方法進(jìn)行研究，確定搗碎是否有利于活性成分溶出，并對(duì)提取方式(包煎與否)和溶劑類型(水或乙醇)進(jìn)行比較研究；以正交設(shè)計(jì)法對(duì)溶劑濃度、溶劑倍數(shù)、提取次數(shù)、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)選，確定最適宜工藝參數(shù)。

本研究起止時(shí)間為2016年6月至2017年6月。

1 儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Milli-Q純水儀，美國(guó)Millipore公司；Mettler AT210十萬分之一電子天平，瑞士METTLER公司；Legend Micro 21R離心機(jī)，賽默飛世爾科技；電熱恒溫水浴鍋，江蘇省醫(yī)療器械廠；IKA RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司；KQ-250E超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)111521-201004)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

菟絲子藥材(批號(hào)130501)，購(gòu)自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院錢士輝研究員鑒定為旋花科植物南方菟絲子CuscutaaustralisR.Br.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1含量測(cè)定方法建立

2.1.1色譜條件[8]色譜柱Alltima C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫35 ℃。此條件下金絲桃苷與雜質(zhì)峰分離度大于1.5，分離良好，如圖1。

2.1.2對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取金絲桃苷對(duì)照品7.2 mg，置于25 mL容量瓶中，加80%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.288 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密量提取液15 mL，置圓底燒瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，精密加入20 mL 80%乙醇，密塞，超聲使充分溶解，離心，取上清液過0.45 μm的微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.1.4線性范圍考察 取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加入80%乙醇稀釋至刻度，依次稀釋成濃度為0.144，0.096，0.072，0.048，0.024，0.012 mg/mL的對(duì)照品溶液，依次吸取系列濃度對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸分析，求得金絲桃苷回歸方程為：Y=3.34×106X-1.70×105(r=0.999 9)，結(jié)果表明金絲桃苷在0.24～2.88 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.096 mg/mL的對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，金絲桃苷峰面積的RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差)為1.1%，表明儀器精密度良好。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn) 同一樣品液按照2.1.3供試品制備方法制備6份供試品溶液，取20 μL注入液相色譜儀，計(jì)算得到金絲桃苷含量為0.044 mg/mL，RSD為2.8%。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定，金絲桃苷含量的RSD為1.5%。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品液7.5 mL，共6份，分別加入一定量的金絲桃苷對(duì)照品，按照2.1.3供試品制備方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果回收率分別為98.0%，101.6%，99.9%，98.8%，101.3%，100.5%，平均加樣回收率為100.0%，RSD為0.7%。

2.2單因素試驗(yàn)考察菟絲子提取工藝根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響菟絲子提取的主要因素提取前處理方法(搗碎與否)、提取方式(包煎與否)和提取溶劑類型(水或乙醇)分別進(jìn)行單因素比較，以確定適宜的提取工藝。

取菟絲子藥材20 g，精密稱定，按照表1各項(xiàng)加10倍量溶劑，加熱回流提取2次，每次1 h，抽濾，合并提取液，定容至500 mL，得提取液1～6號(hào)，按照2.1建立的方法測(cè)定金絲桃苷含量，結(jié)果見表1。

表1 單因素考察菟絲子提取方法

由表1可知，在藥材不搗碎的情況下，水提包煎金絲桃苷提取量比不包煎低38.0%，80%乙醇提包煎金絲桃苷提取量比不包煎低32.5%，包煎不利于有效成分的溶出，水提較醇提有利于有效成分的溶出；在藥材搗碎的情況下，不包煎醇提效果明顯優(yōu)于不包煎水提，而且不包煎醇提在所有平行比較實(shí)驗(yàn)中金絲桃苷提取量最高。綜合上述結(jié)果，筆者認(rèn)為菟絲子采用搗碎后不包煎醇提的方法有利于有效成分的提取。

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)選菟絲子提取工藝參數(shù)

2.3.1正交試驗(yàn)供試品制備及測(cè)定 根據(jù)表1及平行實(shí)驗(yàn)確定的提取條件，對(duì)影響提取工藝的主要因素(A乙醇濃度、B溶劑體積、C提取時(shí)間、D提取次數(shù))按4因素3水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)[9]。各因素水平安排見表2。將菟絲子藥材搗碎，取20 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別按正交試驗(yàn)表中所列條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平行2份，提取液抽濾，合并，根據(jù)實(shí)際得到的體積，適當(dāng)稀釋或濃縮，最終統(tǒng)一定容至500 mL，按照2.1建立的方法測(cè)定金絲桃苷含量，結(jié)果見表3。

表2 菟絲子提取正交試驗(yàn)因素水平

2.3.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)正交試驗(yàn)樣品含量測(cè)定結(jié)果，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行直觀分析及方差分析，結(jié)果見表3,4。

表3 菟絲子提取正交試驗(yàn)安排及直觀分析

注：ki表示任意列上水平號(hào)為i時(shí)所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和；R為極差

表4 綜合評(píng)分方差分析

注：F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.01(2，2)=99，f均為2

由直觀分析可知，極差最大的為A因素，影響因素排序?yàn)锳>D>C>B。說明對(duì)金絲桃苷含量影響最大的為乙醇濃度，其次為提取次數(shù)、提取時(shí)間、溶劑倍數(shù)，最優(yōu)提取工藝參數(shù)為A1D3C2B2；以B為誤差項(xiàng)對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果A差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C、D差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從節(jié)約能源，提高生產(chǎn)效率角度考慮，綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定最佳提取工藝為A1D2C2B2，即10倍量55%乙醇，提取2次，每次1 h。

2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定提取液中金絲桃苷含量，結(jié)果見表5。

表5 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)/%

由表5可見，確定的提取工藝金絲桃苷的平均含量為0.204%，RSD為1.7%，說明工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定可行。

3 討論

種子類藥材由于其種皮致密，傳統(tǒng)一般將其搗碎或炒至爆開白花，使溶劑能進(jìn)入種子內(nèi)部，有利于有效成分的溶出，然而菟絲子在臨床使用時(shí)一般用生品，未經(jīng)任何處理。本研究首次對(duì)菟絲子提取方法進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)菟絲子不搗碎時(shí)，不論是水提還是醇提，不包煎比包煎更有利于有效成分的溶出，可能是因?yàn)椴话遢私z子藥材分散在溶劑中，能充分接觸溶劑，而且在提取的過程中，菟絲子在微沸的溶劑中滾動(dòng)，起到攪拌的作用；根據(jù)菟絲子中活性成分金絲桃苷的理化性質(zhì)，醇提效果應(yīng)該優(yōu)于水提，然而在不搗碎時(shí)，醇提效果不如水提，可能是因?yàn)橐掖嫉臐B透性不如水，難以進(jìn)入菟絲子種子內(nèi)部，有效成分不利于提取出來，一旦菟絲子被搗碎破壁，乙醇就容易進(jìn)入其內(nèi)部，根據(jù)相似相溶原理，其醇提效果就優(yōu)于水提?？傊?，本研究認(rèn)為菟絲子適宜的提取方法為先搗碎，然后采用乙醇提取，不宜包煎。該結(jié)論為同類種子類藥材的提取提供了較好的參考價(jià)值。

一般認(rèn)為，種子類藥材不包煎不利于提取液過濾，藥材搗碎破壁更加增加過濾的難度。但是我們對(duì)含菟絲子的臨床復(fù)方單副藥進(jìn)行煎煮，用100目濾網(wǎng)過濾，由于藥量較少，濾過比較容易，藥渣也能較好地濾除；工業(yè)生產(chǎn)中，隨著制藥設(shè)備的進(jìn)步，大量的藥液可以通過加壓使得提取液快速濾過，因此無論是臨床湯劑的單劑量煎煮，還是工業(yè)大生產(chǎn)，種子類藥材搗碎破壁不包煎都是可行的。

本研究在確定提取方法后，采用正交試驗(yàn)法對(duì)醇提工藝參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，確定了最適宜提取溶劑濃度、溶劑用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定制定的工藝重復(fù)性好，活性成分提取率高，適用于菟絲子的提取。