依達(dá)拉奉對(duì)心搏驟停大鼠心肌保護(hù)作用及水通道蛋白4、水通道蛋白9的作用

李麗

心搏驟停(cardiac arrest，CA)是臨床上最為常見(jiàn)的危重癥之一，是造成心臟猝死主要原因[1]。CA具有高致殘率、高病死率以及低復(fù)蘇成功率等特點(diǎn)，病情兇險(xiǎn)，嚴(yán)重危害了我國(guó)居民的身體健康及生命安全[2]。心肺復(fù)蘇(CPR)是臨床治療CA的關(guān)鍵性搶救措施[3]，但目前臨床CA復(fù)蘇成功率仍很低。有效提高CA病人復(fù)蘇成功率，延長(zhǎng)病人生存時(shí)間是目前臨床亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究采用依達(dá)拉奉干預(yù)CPR后CA模型大鼠，取得良好效果，現(xiàn)作如下報(bào)告。

本研究起止時(shí)間為2014年1月至2016年2月。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物來(lái)源96只健康SD大鼠，體質(zhì)量范圍為220～260 g，購(gòu)于北京華阜康科技有限公司。

1.2主要材料與儀器依達(dá)拉奉注射液(每支30 mg，生產(chǎn)批號(hào)：20140509)，購(gòu)于西安利君制藥有限責(zé)任公司；ALC-V9動(dòng)物呼吸機(jī)，購(gòu)于北京吉安得爾科技有限公司；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，購(gòu)于成都泰盟科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，購(gòu)于長(zhǎng)沙賽晶生物科技有限公司；Trizol、DEPC、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit，購(gòu)于日本TaKaRa公司；DNA Marker，購(gòu)于天根生化科技有限公司；Real-Time PCR儀ABI7500，購(gòu)于美國(guó)ABI公司；水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)、AQP9、β-action PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1模型建立及分組處理 將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(28例)，依達(dá)拉奉組(34例)、生理鹽水組(34例)，依達(dá)拉奉組及生理鹽水組采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，氣管插管備接呼吸機(jī)，動(dòng)、靜脈置管，待大鼠血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后，經(jīng)食道采用快速起搏法誘導(dǎo)CA。CA造模成功5 min后，開(kāi)始實(shí)施CPR，待自主循環(huán)恢復(fù)后，依達(dá)拉奉組立即靜脈注射3 mg/mL依達(dá)拉奉，生理鹽水組給予等體積生理鹽水，假手術(shù)組不誘導(dǎo)CA模型，僅進(jìn)行動(dòng)、靜脈置管及氣管插管。連續(xù)監(jiān)測(cè)三組心電圖及血流動(dòng)力學(xué)1 h后縫合傷口，待依達(dá)拉奉組和生理鹽水組中所有大鼠造模蘇醒后拔除插管，放入籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

CA造模成功標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)脈搏動(dòng)波消失，并且平均動(dòng)脈壓<10 mmHg，心電圖顯示無(wú)脈性電活動(dòng)或心室顫動(dòng)呈一條直線。

自助循環(huán)恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)：心電圖顯示出現(xiàn)包括房性、竇性或者交界性室上性節(jié)律，平均動(dòng)脈壓>20 mmHg，并持續(xù)超過(guò)5 min。

1.3.2觀察指標(biāo) 分別于自主循環(huán)恢復(fù)后12、24、48、72 h，觀察以下指標(biāo)：(1)測(cè)定三組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)心肌組織中SOD、MDA水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行；(2)光學(xué)顯微鏡下觀察三組不同時(shí)間點(diǎn)心肌病理學(xué)變化；(3)測(cè)定三組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量，腦組織含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%；(4)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)三組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織AQP4、AQP9 mRNA水平。

1.3.3RT-PCR檢測(cè)AQP4、AQP9 mRNA水平 自主循環(huán)恢復(fù)后12、24、48、72 h后處死大鼠，采用Trizol抽提法提取腦組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用作RT-PCR檢測(cè)AQP4、AQP9 mRNA水平的模板。設(shè)計(jì)好的AQP4、AQP9以及內(nèi)參β-action引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

反應(yīng)條件：92 ℃預(yù)變性4 min；92 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀掃描成像。凝膠成像儀對(duì)電泳圖像進(jìn)行分析處理后，以AQP4、AQP9 mRNA光密度值占β-action mRNA光密度值百分比為AQP4、AQP9 mRNA相對(duì)含量。公式：AQP4相對(duì)含量=(AQP4 mRNA光密度值/β-action mRNA光密度值)×100%，AQP9 mRNA光密度值=(AQP9 mRNA光密度值/β-action mRNA光密度值)×100%。

2 結(jié)果

2.1三組大鼠處理前基礎(chǔ)參數(shù)比較三組大鼠體質(zhì)量、平均動(dòng)脈壓、舒張壓、收縮壓及心率等基礎(chǔ)參數(shù)比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2三組大鼠心肌組織SOD、MDA水平比較12、24、48、72 h處死大鼠，假手術(shù)組心肌組織中SOD水平均明顯高于依達(dá)拉奉組、生理鹽水組(P<0.05)，MDA水平明顯低于依達(dá)拉奉組及生理鹽水組(P<0.05)，依達(dá)拉奉組心肌組織中SOD水平均明顯高于生理鹽水組(P<0.05)，MDA水平明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3,4。

2.3三組大鼠心肌組織病理形態(tài)比較光學(xué)顯微鏡下觀察三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織病理形態(tài)可見(jiàn)，12 h處死大鼠，假手術(shù)組大鼠心肌纖維互聯(lián)成網(wǎng)，排列整齊，細(xì)胞核染色均勻，細(xì)胞間隙正常，閏盤(pán)清晰染色較深；依達(dá)拉奉組可見(jiàn)心肌組織存在散在片狀壞死灶，心肌細(xì)胞間隙增大，核染色變淺；生理鹽水組心肌組織彌漫性壞死，較之依達(dá)拉奉組更甚。24、48 h處死大鼠，生理鹽水組心肌組織壞死程度及范圍均明顯較依達(dá)拉奉組嚴(yán)重，壞死心肌纖維排列松散紊亂，核染色較淡甚至消失。72 h處死大鼠，生理鹽水組心肌壞死程度明顯高于依達(dá)拉奉組，心肌纖維斷裂，細(xì)胞核稀疏。見(jiàn)圖1。

表1 AQP4、AQP9 及內(nèi)參β-action引物序列

表2 三組大鼠處理前基礎(chǔ)參數(shù)比較結(jié)果

表3 三組大鼠SOD水平比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

2.4三組大鼠腦組織含水量比較12、24、48、72 h處死大鼠，生理鹽水組腦組織含水量均明顯高于依達(dá)拉奉組、假手術(shù)組(P<0.05)，且假手術(shù)組與依達(dá)拉奉組腦組織含水量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5三組大鼠AQP4、AQP9mRNA水平12、24、48、72 h處死大鼠，依達(dá)拉奉組AQP4、AQP9 mRNA水平均明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)表6,7。

3 討論

CA發(fā)生時(shí)，心臟失去正常泵血功能導(dǎo)致機(jī)體組織器官因缺氧缺血而發(fā)生損傷，隨著CA時(shí)間延長(zhǎng)，組織損傷愈嚴(yán)重。及時(shí)實(shí)施CPR有望逆轉(zhuǎn)CA過(guò)程，但目前臨床CA復(fù)蘇成功率以及病人遠(yuǎn)期生存質(zhì)量仍然不佳。相關(guān)資料顯示[4]，北美洲每年大約有50萬(wàn)人接受CPR，但僅有20%～50%病人自主循環(huán)恢復(fù)，且仍有許多病人在自主循環(huán)恢復(fù)后死亡。CA復(fù)蘇成功率低與組織器官缺氧缺血時(shí)間長(zhǎng)短以及繼發(fā)缺血性再灌注密切相關(guān)[5]。研究表明[6]，氧自由基在組織缺血再灌注損傷過(guò)程中起重要作用。依達(dá)拉奉具有有效清除氧自由基的作用而被廣泛應(yīng)用于臨床腦卒中治療方面[7-8]，但其在CA后CPR過(guò)程中是否具有保護(hù)作用尚未完全清楚。因此，本研究旨在探討依達(dá)拉奉干預(yù)CPR后CA模型大鼠對(duì)心肌組織及腦組織的保護(hù)作用，試圖為依達(dá)拉奉應(yīng)用于臨床CA治療提供一定理論依據(jù)。

表4 三組大鼠MDA水平比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表5 三組大鼠腦組織含水量比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表6 三組大鼠AQP4 mRNA水平比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表7 三組大鼠AQP9 mRNA水平比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

SOD是機(jī)體超氧陰離子清除劑，其活性水平可有效反映清除機(jī)體氧自由基能力及抗氧化應(yīng)激能力，MDA是機(jī)體氧自由基攻擊不飽和脂肪酸而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物[9]，其表達(dá)水平可間接反映機(jī)體受到氧自由基攻擊嚴(yán)重程度。依達(dá)拉奉具有較強(qiáng)親脂性，是機(jī)體自由基的捕獲劑，可快速到達(dá)組織降低羥自由基水平，發(fā)揮強(qiáng)大抗氧化作用[10-11]。本研究結(jié)果表明，12、24、48、72 h處死大鼠，假手術(shù)組心肌組織中SOD水平均明顯高于依達(dá)拉奉組、生理鹽水組，MDA水平明顯低于依達(dá)拉奉組及生理鹽水組，依達(dá)拉奉組心肌組織中SOD水平均明顯高于生理鹽水組，MDA水平明顯低于生理鹽水組，提示依達(dá)拉奉可有效清除機(jī)體氧自由基，從而減少M(fèi)DA生成，減少SOD消耗，從而起到減輕心肌組織氧化應(yīng)激損傷作用；病理學(xué)觀察結(jié)果可見(jiàn)，各時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組心肌病理學(xué)損傷程度均高于依達(dá)拉奉組，說(shuō)明依達(dá)拉奉干預(yù)CA后CPR模型大鼠可減輕心肌組織損傷，起到有效心肌保護(hù)作用；CA后實(shí)施CPR的最終目的是盡可能保護(hù)及恢復(fù)病人完整腦功能，依達(dá)拉奉具有分子量很小，水溶性及脂溶性特點(diǎn)，因此十分容易穿透機(jī)體血腦屏障，在腦組織中發(fā)揮強(qiáng)大神經(jīng)保護(hù)作用。AQP4是一類主要分布于軟腦膜、腦室管膜的通道蛋白，是腦膠質(zhì)細(xì)胞與血管及腦脊液間水分轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12]。研究表明[13]，AQP4在腦出血后大量自由基導(dǎo)致腦水腫形成過(guò)程中扮演重要角色，AQP4可能與自由基之間存在著某種聯(lián)系。目前，AQP4已成為腦水腫形成研究的重要熱點(diǎn)。研究表明[14-15]，腦組織AQP9過(guò)度表達(dá)與機(jī)體腦水腫形成同樣存在密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，12、24、48、72 h處死大鼠，依達(dá)拉奉組腦組織含水量均明顯低于生理鹽水組，依達(dá)拉奉組AQP4、AQP9 mRNA水平均明顯低于生理鹽水組，由此可見(jiàn)，依達(dá)拉奉可有效減輕CA后實(shí)施CPR腦水腫，且對(duì)AQP4、AQP9 mRNA表達(dá)具有下調(diào)作用，因此筆者推測(cè)，依達(dá)拉奉減輕大鼠腦水腫的作用機(jī)制為下調(diào)了腦組織中AQP4、AQP9基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，依達(dá)拉奉可減輕CA大鼠CPR后心肌損傷，可通過(guò)下調(diào)AQP4、AQP9表達(dá)減輕大鼠腦水腫，由于CA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，依達(dá)拉奉具體通過(guò)哪些信號(hào)通路發(fā)揮治療作用，有待更進(jìn)一步深入研究。

(本文圖1見(jiàn)插圖4-2)