外源酶處理對(duì)黑毛茶品質(zhì)的影響研究

趙 熙，黃 浩，鐘 妮，余鵬輝，鄭紅發(fā)

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

黑茶是湖南僅次于綠茶的第二大茶類(lèi)。黑毛茶作為黑茶的原料，其品質(zhì)好壞直接影響黑茶品質(zhì)[1]。渥堆是黑毛茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序[2]，濕熱作用和微生物酶促作用貫穿整個(gè)黑毛茶渥堆過(guò)程，其中酶促作用對(duì)黑毛茶品質(zhì)的形成尤為重要，具體表現(xiàn)在葉綠素被破壞、多酚類(lèi)氧化、果膠與糖類(lèi)的水解、香氣物質(zhì)的形成等，最終形成了黑毛茶湯色橙黃明亮、葉底黃褐、滋味醇和、香氣純正的品質(zhì)風(fēng)格[3-5]。

酶工程在茶葉加工中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在利用酶的高效生物催化功能，促進(jìn)茶葉內(nèi)不利及無(wú)效成分的有益轉(zhuǎn)化，改善茶葉的色香味等品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。外源酶主要指不屬于制品本身所固有的外加酶類(lèi)，主要從茶鮮葉、茶幼果及其他植物或其愈傷組織中提取得到，也有些是從培養(yǎng)的微生物中獲得[6]。現(xiàn)代茶葉加工中應(yīng)用較多的外源酶主要有多酚氧化酶、單寧酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶等[7-9]，以達(dá)到醇和茶葉滋味、增加茶葉香氣、改善茶葉品質(zhì)的目的。本研究通過(guò)在黑毛茶的渥堆過(guò)程中添加纖維素酶、蛋白酶、果膠酶和淀粉酶，以期探明不同種類(lèi)的外源酶對(duì)黑毛茶主要生化成分和感官品質(zhì)的影響，為縮短渥堆周期、提升黑毛茶品質(zhì)與質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶鮮葉來(lái)自湖南省茶葉研究所高橋?qū)嶒?yàn)茶場(chǎng)，茶樹(shù)品種為湘波綠2號(hào)，鮮葉采摘時(shí)間2016年9月，采摘標(biāo)準(zhǔn)為機(jī)采一芽三、四葉；纖維素酶（200 U/mg）、蛋白酶（200 U/mg）、果膠酶（200 U/mg）和淀粉酶（10 U/mg）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)用生化試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320 pH 計(jì)、MT203T 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；UV-1801 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗機(jī)：昆山美美超聲儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

分別配制不同濃度水平的酶稀釋溶液，纖維素酶濃度：A1：0.75×104U/mL、A2：1.50×104U/Ml、A3：2.25×104U/mL、A4：3.00×104U/mL、A5：3.75×104U/mL；蛋白酶濃度：B1：1.50×104U/mL、B2：3.00×104U/mL、B3：4.50×104U/mL、B4：6.00×104U/mL、B5：7.50×104U/mL；果膠酶濃度：C1：0.20×104U/mL、C2：0.40×104U/mL、C3：0.60×104U/mL、C4：0.80×104U/mL、C5：1.00×104U/mL；淀粉酶濃度：D1：0.10×104U/mL、D2：0.20×104U/mL、D3：0.30×104U/mL、D4：0.40×104U/mL、D5：0.50×104U/mL。按照液茶比（mL/g）為1 ∶50 的比例將不同濃度的酶液均勻地噴灑在揉捻葉上，用相同方式噴灑蒸餾水作為對(duì)照樣（CK），將處理后的揉捻葉在同一條件下進(jìn)行渥堆工藝處理，24 h 后烘干進(jìn)行后續(xù)分析測(cè)定。

采用的黑毛茶加工工藝：攤青（12 h）-殺青（260 ℃、4 min）-揉捻（15 min）-渥堆（40℃、茶坯含水量65%、24 h）-烘干（90℃、90 min）-黑毛茶成品。

1.3.2 生化成分測(cè)定

水浸出物含量測(cè)定參照GB/T 8305-2013《茶水浸出物測(cè)定》方法；茶多酚含量測(cè)定參照GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》；游離氨基酸總量測(cè)定參照GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量測(cè)定》方法；可溶性糖總量測(cè)定參照蒽酮-硫酸法[10]；可溶性蛋白含量測(cè)定參照考馬斯亮藍(lán)法[10]。

1.3.3 感官品質(zhì)評(píng)定

取茶樣3.0 g，用150 mL 沸水沖泡，靜置 5 min，重復(fù)3 次，密碼審評(píng)各茶樣的香氣、滋味與湯色，用評(píng)分與評(píng)語(yǔ)相結(jié)合的方法反映其品質(zhì)[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2007 和SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度外源酶處理對(duì)黑毛茶品質(zhì)成分的影響

2.1.1 纖維素酶處理

結(jié)果表明，不同濃度纖維素酶處理后的成品黑毛茶茶多酚和水浸出物含量有不同程度的上升趨勢(shì)，游離氨基酸和可溶性蛋白含量則隨纖維素酶濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，可溶性糖含量則呈現(xiàn)先下降后上升再下降的波浪型變化。當(dāng)纖維素酶濃度為A3（2.25×104U/mL）時(shí)茶多酚含量最高，達(dá)到20.75%；當(dāng)纖維素酶濃度為A4（3.00×104U/mL）時(shí)可溶性糖含量和水浸出物總量最高，分別達(dá)到6.71%和42.68%；當(dāng)纖維素酶濃度為A1（0.75×104U/mL）時(shí)，游離氨基酸和可溶性蛋白含量最高，分別為2.97%和1.57%（表1）。

表1 不同濃度纖維素酶處理后主要成分變化（%）Table 1 Changes of main components after different concentrations of cellulase treatment（%）

2.1.2 蛋白酶處理

表2 結(jié)果表明，不同濃度蛋白酶處理后的成品黑毛茶可溶性蛋白、可溶性糖和水浸出物含量有不同程度的上升趨勢(shì)，茶多酚和游離氨基酸含量則隨蛋白酶濃度的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)鞍酌笣舛葹锽5（7.50×104U/mL）時(shí)，茶多酚、游離氨基酸、可溶性蛋白和水浸出物含量達(dá)到最高，分別為20.39%、3.18%、1.61%和48.86%；當(dāng)?shù)鞍酌笣舛葹锽3（4.50×104U/mL）時(shí)，可溶性糖含量最高，為9.12%。

表2 不同濃度蛋白酶處理后主要成分變化（%）Table 2 Changes of main components after different concentrations of protease treatment（%）

2.1.3 果膠酶處理

由表3 可看出，不同濃度果膠酶處理后的成品黑毛茶茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖和水浸出物含量有不同程度的上升趨勢(shì)，但可溶性蛋白含量隨果膠酶濃度的增加變化不大。當(dāng)果膠酶濃度為C3（0.60×104U/mL）時(shí)，水浸出物含量達(dá)到最高，為47.76%；當(dāng)果膠酶濃度為C4（0.80×104U/mL）時(shí)，茶多酚、游離氨基酸和可溶性蛋白含量達(dá)到最高，分別為22.58%、2.74%和1.57%；當(dāng)果膠酶濃度為C5（1.00×104U/mL）時(shí)，可溶性糖含量最高，為8.62%。

表3 不同濃度果膠酶處理后主要成分變化（%）Table 3 Changes of main components after different concentrations of pectinase treatment

2.1.4 淀粉酶處理

表4 結(jié)果表明，不同淀粉酶濃度處理后，除D3（0.30×104U/mL）濃度處理外，其余濃度處理后的茶多酚含量均高于對(duì)照，且D4（0.40×104U/mL）濃度處理后的黑毛茶茶多酚含量最高，為19.80%；而不同濃度淀粉酶處理對(duì)游離氨基酸和可溶性蛋白含量影響不大，D5（0.50×104U/mL）濃度下游離氨基酸含量為2.65%，D1（0.10×104U/mL）濃度下可溶性蛋白含量為1.55%，均小幅高于對(duì)照；除D4 濃度處理外，其余酶濃度處理?xiàng)l件下，可溶性糖含量均高于對(duì)照，且當(dāng)酶濃度為D3 時(shí)，可溶性糖含量最高，達(dá)到8.12%；當(dāng)酶濃度為D5 時(shí)，水浸出物總量最高且高于對(duì)照，達(dá)到44.96%。

表4 不同濃度淀粉酶處理后主要成分變化（%）Table 4 Changes of main components after different concentrations of amylase treatment（%）

2.2 不同濃度外源酶處理對(duì)黑毛茶感官品質(zhì)的影響

從表5 可以看出，纖維素酶A4（3.00×104U/mL）濃度、蛋白酶B3（4.50×104U/mL）濃度、果膠酶C3（0.60×104U/mL）濃度和淀粉酶D3（0.30×104U/mL）濃度處理的黑毛茶感官審評(píng)總分較對(duì)照樣明顯提高，說(shuō)明適量的外源酶處理可以促進(jìn)黑毛茶內(nèi)含品質(zhì)成分的形成，使滋味趨于純和或醇厚，香氣尚純正或較純正，湯色淺橙黃或橙黃明亮；但過(guò)高濃度的外源酶會(huì)導(dǎo)致香氣和滋味帶酸、湯色尚亮或渾濁，影響總體感官品質(zhì)，特別是高濃度的蛋白酶對(duì)黑毛茶香氣品質(zhì)和湯色亮度品質(zhì)影響最大。比較不同種類(lèi)外源酶對(duì)黑毛茶感官品質(zhì)的影響，結(jié)果表明纖維素酶處理后的黑毛茶綜合感官品質(zhì)最好，蛋白酶效果次之，果膠酶和淀粉酶效果相當(dāng)；其中香氣方面，纖維素酶處理后的效果最好，香氣由尚純正、稍悶向較純正轉(zhuǎn)化；滋味方面，外源酶處理均可在不同程度上醇化黑毛茶的滋味，其中蛋白酶效果最好，滋味由尚純和向尚醇厚轉(zhuǎn)化；湯色方面，適量的不同種類(lèi)外源酶處理后均能改善黑毛茶的茶湯亮度，但隨著蛋白酶濃度的增加，茶湯會(huì)出現(xiàn)明顯渾濁現(xiàn)象。

表5 酶處理對(duì)黑毛茶感官品質(zhì)的影響Table 5 Effect of enzyme treatment on sensory quality of raw primary dark tea

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)探討了在渥堆過(guò)程中添加纖維素酶、蛋白酶、果膠酶以及淀粉酶對(duì)黑毛茶品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶及淀粉酶處理都能顯著增加黑毛茶茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖和水浸出物的含量，其中果膠酶對(duì)茶多酚含量變化的影響最大，蛋白酶增加游離氨基酸、可溶性糖及水浸出物含量效果最明顯。對(duì)4種酶處理的黑毛茶成品進(jìn)行感官審評(píng)，結(jié)果表明添加外源酶均可在不同程度上醇化黑毛茶的滋味，其中以蛋白酶效果最好，但蛋白酶濃度過(guò)高易出現(xiàn)酸味和茶湯渾濁現(xiàn)象。比較不同外源酶濃度對(duì)黑毛茶感官品質(zhì)的影響，結(jié)果表明纖維素酶A4（3.00×104U/mL）濃度、蛋白酶B3（4.50×104U/mL）濃度、果膠酶C3（0.60×104U/mL）濃度和淀粉酶D3（0.30×104U/mL）濃度處理對(duì)黑毛茶感官品質(zhì)改善效果最好。

纖維素酶和果膠酶作為細(xì)胞壁水解酶，能夠增加細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)游離氨基酸、多酚類(lèi)物質(zhì)等的溶出，提高水浸出物含量，同時(shí)纖維素酶還能降解多糖類(lèi)物質(zhì)，提高可溶性糖含量[12]；但同時(shí)被破壞的細(xì)胞壁總體結(jié)構(gòu)還會(huì)間接地促進(jìn)呼吸代謝和酶促氧化作用，加速游離氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白等物質(zhì)的消耗和轉(zhuǎn)化以及各個(gè)物質(zhì)的氧化聚合作用，從而導(dǎo)致隨著纖維素酶濃度的增大，游離氨基酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量呈現(xiàn)波浪型變化。蛋白酶能夠促進(jìn)茶葉蛋白質(zhì)的水解，提高茶葉氨基酸的含量[13]。風(fēng)味蛋白酶是內(nèi)切酶與外端酶的復(fù)合酶，在將蛋白質(zhì)降解為胨、短肽的同時(shí)，還可能降解掉不溶性多酚類(lèi)聚合物以及茶多糖中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致茶多酚、可溶性糖和水浸出物的增加，最終逐漸促進(jìn)各物質(zhì)成分在空氣中的氧化過(guò)程。

與傳統(tǒng)黑毛茶工藝相比，在黑毛茶渥堆過(guò)程中添加外源酶有望解決渥堆過(guò)程中微生物復(fù)雜難以質(zhì)控的問(wèn)題，可使工藝簡(jiǎn)化，縮短渥堆時(shí)間的同時(shí)更好地控制渥堆程度，提高產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)僅針對(duì)黑毛茶渥堆過(guò)程中添加纖維素酶、蛋白酶、果膠酶及淀粉酶取得初步研究結(jié)果，而不同茶樹(shù)品種、不同季節(jié)、不同嫩度鮮葉均會(huì)對(duì)黑毛茶品質(zhì)產(chǎn)生影響[14]，并引起對(duì)外源酶種類(lèi)和需要量的變化，因此，如何根據(jù)不同條件配比適合的酶種類(lèi)和數(shù)量是今后外源酶在黑毛茶加工中應(yīng)用需要解決的問(wèn)題之一。