膽石癥患者血清微小RNA-122、高遷移率族蛋白1和角蛋白-18水平及其臨床意義*

程鐵軍，張明智

血清學指標對膽石癥也具有一定的判斷價值，miR-122、高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB 1）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解角蛋白-18（cysteine aspartate protease cleavage keratinocyte-18，CCK-18）曾作為急性肝損傷的標志物，因為miR-122僅表達于肝細胞，通過調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸代謝，參與膽結(jié)石的發(fā)生和發(fā)展[1-4]，而HMGB 1和CCK-18是由免疫細胞和壞死細胞釋放的具有促炎活性的核結(jié)合蛋白，兩者均為肝上皮細胞的標志物[5]。動物實驗表明[6]，膽管結(jié)扎后動物血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平升高。本研究檢測了膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平變化，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年1月～2018年2月我院收治的膽石癥患者201例，男性69例，女性132例；平均年齡為（49.6±6.1）歲。所有膽石癥患者均經(jīng)超聲和CT檢查診斷，其中膽色素型膽管結(jié)石68例（33.8%）、膽固醇型膽管結(jié)石71例（35.3%）、混合型膽管結(jié)石61例（30.8%）。BMI為（23.9±3.9）kg/m2。根據(jù)疾病嚴重程度，將患者分為單純性膽石癥組（n=97）和復雜性膽石癥組（n=104）。復雜性膽石癥診斷標準[7]為：（1）膽囊纖維化嚴重或Calot三角粘連、瘢痕化、脂肪堆積、分離難度大；（2）膽囊前三角區(qū)與后三角區(qū)之間界限不清；（3）膽囊嚴重炎性水腫或萎縮。符合其中1項者，則診斷為復雜性膽石癥。納入標準為：（1）膽囊結(jié)石診斷明確，伴或不伴繼發(fā)性膽總管結(jié)石；（2）無梗阻性黃疸表現(xiàn)。排除標準：（1）伴有急性膽道感染；（2）合并膽道腫瘤；（3）伴有嚴重的膽源性胰腺炎；（4）入組前曾接受過外科治療患者。選擇同期健康體檢者103例作為對照，男性45例，女性58例；平均年齡為（50.5±5.8）歲，BMI為（23.5±3.5）kg/m2。兩組人群性別、年齡和BMI比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者簽署知情同意書，本研究獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 觀察指標 采用RT-PCR法測定血清miR-122水平；采用ELISA法測定血清HMGB 1和CCK-18水平（試劑盒購自上海創(chuàng)祥生物科技有限公司）。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSSS 22.0和Medcalc 16.2軟件進行統(tǒng)計學分析。首先進行正態(tài)性分布檢驗，對正態(tài)分布的計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。對非正態(tài)分布的計量資料以【M（Q1，Q3）】表示，組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。計數(shù)資料以n（%）表示，采用卡方檢驗。以患者病情嚴重程度為因變量，以Child分級、肝硬化、膽結(jié)石分期、腹腔積液、血清白蛋白、miR-122、HMGB 1和CCK-18作為自變量，建立Logistic回歸模型，構(gòu)建miR-122、HMGB 1和CCK-18診斷的ROC曲線，計算曲線下面積（AUC）。取約登指數(shù)（靈敏度+特異度-1）最大處作為各指標診斷復雜性膽石癥的截斷點。P＜0.05被定義為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平比較 膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平均顯著高于健康人，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 1）。

表1 兩組血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平[M（Q1,Q3），（±s）]比較

表1 兩組血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平[M（Q1,Q3），（±s）]比較

膽石癥健康人統(tǒng)計值P例數(shù)201 103 miR-122 4.7（0.9，14.3）0.9（0.4，3.1）6.107＜0.001 HMGB1（ng/mL）2.5±0.7 2.1±0.4 6.332＜0.001 CCK-18（U/L）126.8±20.5 101.4±18.7 10.845＜0.001

2.2 不同嚴重程度膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平比較 97例單純性膽石癥患者血清 miR-122、HMGB 1和 CCK-18水平分別為 3.5（0.7，8.5）、（2.2±0.5） ng/mL 和（112.4±19.4） U/L，顯著低于104例復雜性膽石癥患者【分別為5.8（0.9，16.2）、（2.8±0.8） ng/mL 和 （140.2±23.5） U/L，Mann-Whitney U=3.107，P=0.016；Mann-Whitney U=6.241，P＜0.001；Mann-Whitney U=9.171，P＜0.001】，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 影響單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的單因素分析 單因素分析顯示，兩組在性別、年齡、BMI、既往手術(shù)史和糖尿病方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而兩組在肝硬化和腹腔積液方面比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 2）。

表2 影響復雜性膽石癥發(fā)生的單因素[n（%），（±s）]分析

表2 影響復雜性膽石癥發(fā)生的單因素[n（%），（±s）]分析

單純性（n=97） 復雜性（n=104） x2/t P性別男32（33.0） 37（35.6） 0.149 0.699女65（67.0） 67（64.4）年齡（歲） 52.4±6.5 51.3±5.2 1.319 0.187 BMI（kg/m2）23.7±4.024.1±4.30.6830.494肝硬化是26（26.8） 69（66.3） 18.418 ＜0.001否71（73.2） 35（33.7）既往手術(shù)史有13（13.4） 18（17.3） 0.587 0.444無84（86.6） 86（82.7）糖尿病是20（20.6） 25（24.0） 0.338 0.561否77（79.4） 79（76.0）腹腔積液是24（24.7） 47（45.2） 9.187 0.002否73（75.3） 57（54.8）

2.4 影響單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的多因素分析 將單因素分析有統(tǒng)計學意義的因素，如肝硬化、腹腔積液、血清miR-122、HMGB 1和CCK-18作為自變量，將膽石癥嚴重程度作為因變量納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，肝硬化、腹腔積液、miR-122、HMGB 1和CCK-18水平為單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的危險因素（表3）。

2.5 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平聯(lián)合檢測診斷復雜性膽石癥的效能分析 在單指標檢測方面，血清CCK-18與miR-122或HMGB 1比，其診斷效能差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.839，P=0.401；Z=1.266，P=0.206）；應用血清 miR-122、HMGB 1和CCK-18水平聯(lián)合檢測診斷復雜性膽石癥的模型為：F=-7.098+0.309×miR-122+1.297×HMGB 1+0.019×CCK-18，即聯(lián)合檢測診斷復雜性膽石癥的AUC顯著高于miR-122或HMGB 1單指標檢測（Z=2.694，Z=3.419，P=0.007，P=0.001，表4，圖 1）。

表3 影響單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的多因素分析

圖1 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18聯(lián)合檢測診斷復雜性膽石癥的ROC曲線比較

表4 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18聯(lián)合檢測診斷復雜性膽石癥的效能分析

3 討論

血清學指標在診斷膽結(jié)石等疾病中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，其不受膽結(jié)石解剖位置的影響，可以較好地預測膽結(jié)石患者的病情，為臨床治療提供依據(jù)[8-11]。我們檢測了膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平變化，并探討了三者與膽石癥病情的關(guān)系，以期為臨床早期判斷膽石癥患者病情提供參考。

miR-122在肝臟特異性表達，占肝臟miRNA總量的70%，具有調(diào)節(jié)脂肪酸及膽固醇代謝的功能[12]。HMGB 1和CCK-18均為機體內(nèi)促炎性蛋白，為肝細胞炎性標志物。動物實驗[13]表明，當膽囊受到損傷時，血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平呈現(xiàn)升高的趨勢。本研究結(jié)果顯示，膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平顯著高于健康人，提示其可作為判別膽結(jié)石患者病情的潛在生物學指標。本研究結(jié)果顯示，復雜性膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平顯著高于單純性膽石癥患者，更提示其與患者病情的關(guān)系。為進一步分析影響單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的相關(guān)危險因素，本研究采用單因素和多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示存在肝硬化、有腹腔積液、血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平升高為復雜性膽石癥的危險因素。在肝硬化時，患者肝功能受損，影響了胃腸激素的滅活，促進了膽結(jié)石的發(fā)生發(fā)展[14-16]。在肝功能受損后，腹腔積液增多且白蛋白水平降低，腹腔積液的長期存在和低蛋白血癥易導致膽囊壁增厚，甚至膽囊纖維化，導致膽囊收縮能力下降，膽汁淤積，形成結(jié)石[17，18]。miR-122通過抑制脂肪酸和膽固醇代謝，造成膽囊膽固醇過量積聚，導致結(jié)石形成[19]。CCK-18為參與膽囊運動調(diào)節(jié)的激素，CCK-18水平升高，胰腺消化酶分泌減少，誘發(fā)膽囊結(jié)石進一步發(fā)展[20]。本研究同時分析血清miR-122、HMGB 1和CCK-18診斷復雜性膽石癥的效能，結(jié)果顯示，三者單獨檢測時，AUC值介于0.7～0.8之間，而采用三者聯(lián)合檢測診斷復雜性膽石癥，結(jié)果顯示可將診斷的AUC提高至0.819，顯著高于三者的單獨檢測，表明聯(lián)合檢測可最大限度地避免對病情的誤判。