慢性乙型肝炎患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比的變化及其臨床意義探討

周積云，馬 勇，丁體龍，涂遠(yuǎn)航，陳 策

自提出共刺激通路激活機(jī)制后，CD28分子成了免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)[1-4]。CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞又被稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，其可通過釋放穿孔素、顆粒酶和特殊的細(xì)胞因子殺傷靶細(xì)胞[5-8]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在結(jié)腸癌患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞比例較正常人降低，而在自身免疫性疾病和鉤蟲感染患者外周血，其比例則升高[9，10]，表明CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的降低與疾病的發(fā)生存在一定的關(guān)系，因?yàn)楹笳邔?duì)機(jī)體免疫應(yīng)答狀態(tài)有重要的影響。本研究檢測(cè)了處于不同感染階段的CHB患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比，以探討其變化與免疫應(yīng)答的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年4月～2018年8月蚌埠市解放軍第902醫(yī)院肝病中心收治的CHB患者88例，男性56例，女性32例；年齡為11～67歲，平均年齡為34.9±13.3歲。符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。分組標(biāo)準(zhǔn)定義免疫耐受期為血清HBsAg和HBeAg陽性，血清HBV DNA水平＞200 000 IU/mL，血清ALT水平正常，肝組織學(xué)檢查無明顯異常或輕度的炎癥，無或僅有輕度的肝纖維化；免疫清除期為血清HBV DNA水平＞2 000 IU/mL，血清ALT水平持續(xù)或間歇升高，肝組織學(xué)表現(xiàn)為中度或嚴(yán)重的炎癥壞死，肝纖維化明顯或進(jìn)展；非活動(dòng)期為血清HBeAg陰性，抗-HBe陽性，血清HBV DNA水平低或檢測(cè)不到（＜2 000IU/mL），血清ALT水平正常，肝組織學(xué)無炎癥或輕度炎癥；再活動(dòng)期為血清HBeAg陰性，抗-HBe陽性，HBV DNA 呈中等至高水平復(fù)制（＞20 000 IU/mL）,血清ALT水平持續(xù)或反復(fù)異常，肝組織學(xué)無炎癥或輕度炎癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：已進(jìn)行抗病毒治療的非初治患者、脂肪性肝病、酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病或合并其他病毒感染的慢性肝病、近兩個(gè)月來應(yīng)用過糖皮質(zhì)激素、α-干擾素等影響免疫功能的藥物的患者。另在解放軍第902醫(yī)院體檢中心選擇健康成人20例，男性13例，女性7例；年齡21～56歲，平均年齡為33.0±10.0歲。所有納入人群簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 檢測(cè)方法 使用DxP Athena流式細(xì)胞儀（美國(guó)CYTEK公司）檢測(cè)外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞，抗 CD3-FITC、抗 CD3-APC、抗 CD8-PE-Cy7、抗CD28-APC和抗mIgG1-APC（美國(guó)BD公司）。取流式管，分別加入抗體和外周血50 μL，充分混勻，避光染色30 min；加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，避光10 min；1500 r/m離心5 min，棄上清；加入SB 1.5 mL，1500 r/m離心5 min，棄上清；加20 g/L PFA 200 μL，4℃避光保存或上機(jī)檢測(cè)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照管、每種熒光抗體的補(bǔ)償調(diào)節(jié)管和抗CD28的同型對(duì)照管。應(yīng)用Flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Roche cobase 411儀器（瑞士Roche公司）采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)外周血HBsAg水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同感染階段的CHB患者與健康人外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比比較 見表1和圖1～5。

表1 不同人群外周血指標(biāo)和CD28+T淋巴細(xì)胞（%±s）比較

表1 不同人群外周血指標(biāo)和CD28+T淋巴細(xì)胞（%±s）比較

與健康人比，①P＜0.05；與免疫耐受期患者比，②P＜0.05

例數(shù) HBV DNA（lg copies/mL） ALT（U/L） HBeAg/抗HBe（U/mL） CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞健康人 20 - 25.0±8.2 -/- 26.1±3.5免疫耐受期 20 8.1±0.7 34.4±10.6 145.4±32.4/- 26.3±3.4免疫清除期 28 5.9±1.3② 206.3±71.6①② 131.1±35.3②/- 40.1±4.7①②非活動(dòng)期 20 - 42.7±7.0 -/53.7±4.6 20.3±2.2再活動(dòng)期 20 6.8±1.2 320.0±77.1① -/54.0±5.5 21.9±2.2

圖1 健康人外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比

圖2 免疫耐受期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比

圖3 免疫清除期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比

圖4 非活動(dòng)期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比

圖5 再活動(dòng)期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比

2.2 不同血清HBsAg水平的CHB患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比 見表2。

表2 不同HBsAg水平患者CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比（%±s）

表2 不同HBsAg水平患者CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比（%±s）

與HBsAg低水平組比，①P＜0.05；與HBsAg中度水平組比，②P＜0.05

血清HBsAg（IU/ml） 例數(shù) CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞0～500 32 24.0±7.5 500～2000 28 28.4±8.9①＞2000 28 33.2±8.5①②

3 討論

CD28分子是由220個(gè)氨基酸組成，被糖基化等修飾形成為44kDa的同源二聚體，為二硫鍵所連接，位于細(xì)胞表面，配體為 B7-1（CD80）和 B7-2（CD86）[12，13]。CD28 分子主要表達(dá)于 95%CD4+T淋巴細(xì)胞和50%CD8+T淋巴細(xì)胞表面。CD28與B7配體的結(jié)合為T細(xì)胞活化、增殖提供第二信號(hào)。特異性細(xì)胞免疫是慢性乙型肝炎機(jī)體特異性清除病毒的關(guān)鍵，同時(shí)也是造成肝臟急、慢性炎癥損傷的關(guān)鍵。

本研究對(duì)88例慢性乙型肝炎患者和20例健康成人外周血進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在不同病程階段患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比有明顯的差異。在慢性乙型肝炎自然病程中，免疫耐受期一般出現(xiàn)在HBV感染早期，表現(xiàn)為血清HBV載量高（＞200000IU/mL），肝臟無明顯損傷或僅表現(xiàn)為輕度的炎性損傷。本研究結(jié)果顯示，免疫耐受期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可能與肝臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞對(duì)CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞增殖、分化起到抑制作用有關(guān)。肝臟作為人體內(nèi)最大的代謝器官及免疫器官，具有雙重血液供應(yīng)，其3/4的血液來自門靜脈系統(tǒng)，使肝臟組織在更大程度上面對(duì)食物和腸道微生物的刺激，做出反應(yīng)。同時(shí)，肝臟需要生成無數(shù)新的抗原物質(zhì)，其本身的這種特殊解剖結(jié)構(gòu)及功能使其具有免疫耐受傾向的特點(diǎn)。“慢性乙型肝炎防治指南”不建議對(duì)免疫耐受期患者進(jìn)行抗病毒治療[11]。

國(guó)內(nèi)有學(xué)者對(duì)HBV感染免疫耐受期患者進(jìn)行肝臟組織學(xué)檢查和外周血ALT檢測(cè)表明，免疫耐受期患者表現(xiàn)為ALT正?；騼H輕度異常，但肝臟組織活檢顯示大部分患者肝臟均出現(xiàn)炎癥，部分已出現(xiàn)肝纖維化,免疫耐受期是導(dǎo)致HBV感染慢性化的重要原因之一[14]。因此，通過誘導(dǎo)CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞增殖、分化，從而打破HBV感染的免疫耐受，提高抗病毒應(yīng)答及血清轉(zhuǎn)換，來防止HBV感染慢性化，可作為治療慢性乙型肝炎的一個(gè)思路。

同時(shí)，本研究結(jié)果顯示免疫清除期患者CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比明顯高于正常對(duì)照組及其他病程階段組，此時(shí)CD28大量表達(dá)，CD28/B7共同刺激通路激活，通過分泌穿孔素以及激活FasL對(duì)HBV進(jìn)行殺傷作用，在清除期表現(xiàn)為血清HBV DNA載量下降，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，肝臟組織有炎性損傷或壞死，表明CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞與機(jī)體清除病毒以及肝臟損傷都密切相關(guān)，也說明了CD28的激活是把雙刃劍。在低復(fù)制期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞水平低于正常對(duì)照組，隨著病程慢性化，HBV對(duì)肝臟的長(zhǎng)期慢性損傷，可能導(dǎo)致肝臟對(duì)病毒的刺激敏感性降低，即使處在再活動(dòng)期時(shí)，僅能激起CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞的輕度升高，但仍低于正常人。不同病程階段慢性乙型肝炎患者CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞水平的差異導(dǎo)致不同階段肝臟免疫功能狀態(tài)不同，使肝臟對(duì)HBV的清除以及肝臟自身炎癥、壞死、纖維化的進(jìn)展也各不相同。因此，針對(duì)慢性乙型肝炎的階段化治療至關(guān)重要。

HBV的外膜（envelope）蛋白是由S基因編碼合成的，主要包括大蛋白、中蛋白和主蛋白（即HBsAg）[15]。HBsAg由226個(gè)氨基酸組成，攜帶全部抗原反應(yīng)表位，是臨床檢驗(yàn)是否感染HBV的一項(xiàng)重要指標(biāo)。檢測(cè)HBsAg較簡(jiǎn)單，特異性、敏感性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于臨床[16，17]。在臨床治療中，僅出現(xiàn)持續(xù)病毒學(xué)和（或）出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，并不能達(dá)到治愈的標(biāo)準(zhǔn)，只有出現(xiàn)持續(xù)的HBV檢測(cè)不到且伴有HBsAg轉(zhuǎn)陰和（或）出現(xiàn)抗-HBs才能達(dá)到完全治愈，HBsAg在臨床檢測(cè)HBV感染以及慢性乙型肝炎治療中有重要的指導(dǎo)作用。有研究表明，HBsAg水平與慢性乙型肝炎病程具有相關(guān)性，其中在免疫耐受期其水平最高，其次為免疫清除期，低復(fù)制期HBsAg 水平最低[18，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg 水平與CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞具有相關(guān)性，HBsAg量越高，外周血CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞百分比越高。因此，HBsAg水平在一定程度上可間接反映肝臟免疫反應(yīng)激活的程度，從而指導(dǎo)臨床治療。

CD28分子驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)重要的生化反應(yīng)，包括特殊磷酸化、轉(zhuǎn)錄以及重要細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在T細(xì)胞增殖及活化過程中起到了重要的作用。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用CD28分子拮抗劑可預(yù)防自身免疫性疾病和器官排斥反應(yīng)[20，21]。在慢性乙型肝炎抗病毒治療過程中，不同病程階段機(jī)體對(duì)抗病毒藥物的敏感性不同，與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)有關(guān)，是否可以通過CD28分子激活劑來提高機(jī)體CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞的增殖，從而提升機(jī)體對(duì)乙型肝炎病毒的殺傷作用，以提高抗病毒應(yīng)答率，以及利用CD28拮抗劑在非活動(dòng)期減緩肝臟炎性損害，減緩慢性乙型肝炎病程進(jìn)展，有待下一步研究。