循環(huán)microRNA早期診斷肝細(xì)胞癌研究現(xiàn)狀及方法學(xué)探討

趙西太綜述，聶青和審校

microRNA（miRNA）可能是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）潛在的血清學(xué)標(biāo)志物，具有良好的臨床應(yīng)用潛力，可彌補血清AFP和影像學(xué)早期發(fā)現(xiàn)的不足，成為HCC早期診斷的理想候選方法[1]。本文就miRNA診斷HCC相關(guān)研究現(xiàn)狀進(jìn)展進(jìn)行綜述，并探討其方法學(xué)及臨床前景。

1 miRNA概述

miRNA是長度為19～25核苷酸的單鏈非編碼RNA，序列高度保守，lin-4是1993年在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的第一個miRNA，隨后在植物、微生物、哺乳動物等不同物種中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)種類眾多的miRNA，miRNA權(quán)威數(shù)據(jù)庫miRBase 2014年收錄的人成熟miRNA序列就有2588條[2]。

miRNA編碼基因位于全基因組非編碼區(qū)及編碼基因內(nèi)含子，常見多個miRNA簇集現(xiàn)象。miRNA主要由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，依次在核內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)蛋白DGCR8及III型核糖核酸內(nèi)切酶Drosha、Dicer作用，形成雙鏈miRNA，隨后立即與AGO蛋白結(jié)合組裝為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducing silencing complex，RISC），成熟單鏈miRNA保留在RISC上，另一條鏈被降解[3]。

miRNA主要以RISC的形式發(fā)揮作用，其中miRNA與信使 RNA（messenger RNA，mRNA）調(diào)控區(qū)的 3'或 5'非編碼區(qū)互補結(jié)合，阻斷mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解，使相應(yīng)靶基因沉默或低表達(dá)，發(fā)揮基因抑制作用[4]。miRNA參與調(diào)控個體發(fā)育、細(xì)胞增殖/分化、細(xì)胞死亡、代謝等生物學(xué)過程，在基本生命活動及多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。如何將miRNA與疾病的臨床管理中聯(lián)系起來是研究熱點，目前集中于癌癥的早期診斷、慢性疾病的治療監(jiān)測、預(yù)后預(yù)測等。

2 miRNA與HCC的關(guān)系

HCC發(fā)病、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等病理過程受許多miRNA調(diào)節(jié)。miRNA-484在肝硬化或慢性HBV感染的肝臟內(nèi)表達(dá)上調(diào)，易致高度不典型增生結(jié)節(jié)形成并促其癌變[5]。肝臟腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）在 HCC 的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥及其他惡性表型中發(fā)揮重要作用，miR-130b、miR-1246在CSC中高表達(dá)，賦予CSC更強的增殖、自我更新、腫瘤形成和耐受化療的能力，可能與HCC的進(jìn)展和復(fù)發(fā)、耐藥有關(guān)[6]。HCC抑制性miRNA也較常見，miR-199a/b-3p下調(diào)絲/蘇氨酸蛋白激酶PAK4的表達(dá)，對HCC生長發(fā)揮抑制作用[7]；miR-206可減緩HCC細(xì)胞生長、增殖速度，誘導(dǎo)凋亡，小鼠實驗中表現(xiàn)出顯著的HCC抑制和腫瘤治療作用[8]。此外，HCC侵襲性和轉(zhuǎn)移能力也受miRNA調(diào)控，miR-151在HCC中過表達(dá)，提高癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，與HCC肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]；miR-122可抑制人HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)，過表達(dá)的miR-1247-3p可隨外泌體遠(yuǎn)距作用于成纖維細(xì)胞，均能促進(jìn)HCC的轉(zhuǎn)移[10]。在HCC中表達(dá)水平發(fā)生顯著變化且與發(fā)病機制密切相關(guān)的miRNA可不同程度提示HCC的發(fā)生，有望成為HCC血清學(xué)標(biāo)志物。

3 循環(huán)miRNA診斷HCC研究現(xiàn)狀

3.1 單個miRNA診斷HCC 循環(huán)miRNA診斷HCC的研究較多，目前經(jīng)臨床試驗驗證有診斷價值的miRNA多達(dá)數(shù)十種，診斷效能高低不一，且隨著對照組（健康人群或慢性肝病、肝硬化等）及HCC誘因不同而表現(xiàn)出明顯差異[11]。以下介紹幾種研究較多的HCC診斷相關(guān)miRNA。

3.1.1 miR-122是肝臟特異性miRNA 肝臟miR-122豐富，在HCC組織中表達(dá)水平則顯著下降，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、促進(jìn)HCV復(fù)制和抗凋亡的功能[12]。miR-122沉默表達(dá)的HCC細(xì)胞系中，AFP表達(dá)水平升高，而促進(jìn)AFP表達(dá)的p53和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）活性無明顯變化，表明miR-122可能具有抑制AFP表達(dá)的作用[13]。另外，miR-122可抑制人HCC細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC肺轉(zhuǎn)移。血清/血漿miR-122診斷HCC的研究較多，一項納入4個研究的薈萃分析表明[14]，循環(huán)miR-122其區(qū)分HCC與健康對照的ROC曲線下面積（AUC）、敏感度、特異度分別為0.82、76%、75%，而對照組為慢性肝病時分別為 0.77、70%、73%。可見miR-122在HCC診斷方面具有一定臨床應(yīng)用價值。

3.1.2 miR-21在HCC組織高度過表達(dá) miR-21作用于Hbp1-p53-Srebp1c通路，可促進(jìn)肝臟脂質(zhì)蓄積和HCC進(jìn)展[15]。Zhou[16]以健康人、慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者為對照，發(fā)現(xiàn) miR-21單獨診斷 HCC的 AUC為 0.626。Tomimaru et al[17]研究認(rèn)為miR-21區(qū)分HCC與健康人的能力較強（AUC=0.953），但鑒別慢性肝炎與HCC較難（AUC=0.773）。因此，miR-21診斷HCC的能力與對照組有關(guān)，受基礎(chǔ)肝病狀態(tài)影響很大，其應(yīng)用價值仍需進(jìn)一步研究。

3.1.3 miR-223在HCC細(xì)胞系中低表達(dá) miR-223可作用于靶基因Rab1及mTOR信號通路，誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡[18]。Dong等[19]研究認(rèn)為在HCC組織中高表達(dá)的硫腦苷脂可通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控的方式抑制miR-223，從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。Zhou等[16]以健康人、慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者為對照，發(fā)現(xiàn)miR-223診斷HCC的AUC為0.643。而Xu[20]研究發(fā)現(xiàn)，以健康人為對照時，miR-223診斷HCC的準(zhǔn)確性較好（AUC=0.86），但不能有效鑒別HCC與慢性肝炎。在HCC診斷方面，miR-223與miR-21類似，仍需進(jìn)一步臨床研究。

3.1.4 miR-192可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞系HepG2凋亡 miR-192水平受HBV病毒蛋白抑制[21]。Zhou[16]以健康人、慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者為對照，發(fā)現(xiàn)miR-223診斷HCC能力較差（AUC為0.569）。Motawi et al[22]研究發(fā)現(xiàn)miR-223區(qū)分HCC與健康人的能力較強（AUC=0.878），而與慢性肝病、重度肝纖維化鑒別較難（AUC 為 0.69、0.73）。而 Tan[23]研究認(rèn)為，miR-192診斷HCC能力不強（AUC=0.690），區(qū)分健康人和肝硬化患者的能力也較差（AUC為0.695、0.687）。因此，miRNA單獨用于診斷HCC的價值仍不明確，需進(jìn)一步研究。

3.1.5 miR-26a在HCC組織中低表達(dá) 正常水平或人為過表達(dá)的miR-26a可抑制IL-6-Stat3信號通路，進(jìn)而抑制HCC的生長和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，亦可通過抑制生長因子-cMet通路減少HCC的血管生成[24]。Zhou[16]研究發(fā)現(xiàn)，以健康人、慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者為對照，miR-26a診斷HCC的AUC為0.665。Tan[23]研究結(jié)果表明，miR-26a診斷HCC能力較差（AUC為0.677），以健康人、肝硬化患者作對照分層分析AUC 稍高（0.744、0.762）。

3.2 miRNA聯(lián)合診斷HCC Zhang[25]利用miRNA芯片在3株HCC細(xì)胞系和志愿者（HCC及健康對照）血清中篩選，并利用實時定量PCR在小樣本（n=57）血清中驗證，得到5個異常表達(dá)的miRNA；之后在大型隊列（115例HCC，40例健康對照）中用logistic回歸模型構(gòu)造多miRNA診斷指標(biāo)并聯(lián)合AFP進(jìn)行診斷試驗，結(jié)果表明，miR-92-3p、miR-107、miR-3126-5p聯(lián)合AFP的AUC、敏感度、特異度為0.994、100%和96.5%，且診斷早期HCC準(zhǔn)確度很高（0.988，100%，96.2%）。Lin等[26]用類似方法得到 7 個 miRNA（miR-29a、miR-29c、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-192 和 miR-505）組成的診斷指標(biāo)，其診斷HCC的準(zhǔn)確性優(yōu)于截斷點為20ng/ml、400ng/ml的AFP （0.817～0.884，74.5%～85.7%，88.9%～91.1%vs.0.709～0.796，56.9%～59.2%，84.9%～100%vs.0.657～0.704，31.4%～40.8%，100%），且發(fā)現(xiàn)臨床前HCC的能力顯著優(yōu)于AFP（AUC為 0.752 vs.0.593～0.593）。Zuo[27]聯(lián)合 miR-125b、miR-223、miR-27a、miR-26a診斷HCC的AUC、敏感度、特異度分別為0.796、85.5%、70.0%（對照組為慢性乙型肝炎和健康對照），但區(qū)分慢性乙型肝炎和HCC的能力稍差（0.687，81.8%，53.3%）。

上述研究提示，多miRNA聯(lián)合診斷HCC效能明顯優(yōu)于單個miRNA及AFP，同時聯(lián)合AFP可進(jìn)一步提高診斷效能。不過，針對不同高危因素（乙型肝炎、丙型肝炎等）的HCC患者，所選擇的miRNA種類差別很大，診斷準(zhǔn)確性差異也較大；而不同研究者研究同一類人群，得到的miRNA組合亦不盡相同；miRNA發(fā)現(xiàn)臨床前HCC的能力仍有待進(jìn)一步研究。

4 循環(huán)miRNA診斷HCC的方法學(xué)探討

4.1 循環(huán)miRNA作為HCC診斷標(biāo)志物的優(yōu)勢和不足 循環(huán)miRNA用于HCC診斷具有明顯優(yōu)勢。miRNA廣泛存在于人體體液中，包括血漿/血清、尿液、腦脊液、胸水、淚液、乳汁、精液、羊水、唾液、支氣管灌洗液、腹水和初乳[28]，其中循環(huán)miRNA包裹于外泌體或微泡內(nèi)，或與蛋白質(zhì)結(jié)合（主要是Ago2和高密度脂蛋白）[29]，理化性質(zhì)穩(wěn)定，可抵抗血漿/血清內(nèi)源性核糖核酸酶的分解，可耐受較長時間（24小時）室溫靜置、pH值波動和反復(fù)凍融[30]，就臨床樣本特性而言miRNA是十分理想的標(biāo)志物。此外，miRNA具有一定HCC特異性。多種miRNA在原發(fā)性肝癌組織中表達(dá)水平顯著異于正常肝組織，意味著相應(yīng)miRNA具有肝癌特異性，miRNA直接參與或間接涉及原發(fā)性肝癌發(fā)病機制、侵襲或轉(zhuǎn)移過程。

循環(huán)miRNA作為診斷標(biāo)志物的主要不足是血清豐度很低，對檢測技術(shù)要求高。目前主要檢測方法為相對定量PCR，但常用內(nèi)參基因RNU6-1、RNU44和RNU48并不理想，而miRNA提取方法、提取試劑盒不同可造成miRNA樣本不同程度的損失，最終影響miRNA定量檢測的準(zhǔn)確性，使不同實驗室的研究結(jié)果可比性不佳，據(jù)此進(jìn)行的薈萃分析結(jié)果是否可信有待商榷[31]。

4.2 如何選擇適當(dāng)?shù)膍iRNA進(jìn)行HCC診斷 2001年美國癌癥研究協(xié)會提出腫瘤標(biāo)志物研究的5期標(biāo)準(zhǔn)，評價腫瘤標(biāo)志物的臨床意義和應(yīng)用價值時可供參考（附表）[32]。目前進(jìn)行HCC診斷研究的循環(huán)miRNA種類繁多，大多處于I期、II期階段，僅有個別研究推進(jìn)到了III期[26]。

附表 腫瘤標(biāo)志物研究的5期標(biāo)準(zhǔn)

選擇合適的miRNA是診斷研究的第一步。HCC發(fā)病機制相關(guān)、肝臟組織特異性、血液中可測得變化是選擇診斷用循環(huán)miRNA的常用標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)功能相關(guān)性選擇miRNA具有一定盲目性，需要臨床樣本進(jìn)行確認(rèn)。有鑒于此，有研究者利用基因芯片等高通量方法篩選HCC患者血清中異常表達(dá)的miRNA，然后擴大樣本驗證所選miRNA診斷HCC的準(zhǔn)確性[26]。該方法容易得到目標(biāo)miRNA，但假陽性率高，所選miRNA特異性不佳為其主要缺點。近年來，大型癌癥基因組數(shù)據(jù)庫（如TCGA）建立并對外開放，為研究者提供miRNA在HCC中表達(dá)情況的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，使得生物信息學(xué)分析方法發(fā)掘目的miRNA成為可能[33]。生物信息學(xué)方法的優(yōu)勢在于篩選miRNA的樣本量大，得到的目的miRNA更可靠，且大幅節(jié)約研究時間和費用[34]。

HCC異質(zhì)性強，腫瘤內(nèi)部同時存在多種表型、分化程度、代謝特點不同的癌細(xì)胞，而不同患者HCC的病理、分子生物學(xué)特征也不盡相同，某種miRNA的變化未必出現(xiàn)于所有HCC中，因此單個miRNA診斷HCC可能導(dǎo)致較多的假陰性結(jié)果。薈萃分析表明，血清miRNA診斷HCC總體價值較高，能從健康人、慢性肝炎和肝硬化對照中高效辨別出HCC；單個miRNA診斷HCC效果往往不高，聯(lián)合AFP可提高診斷效能，多個miRNA聯(lián)合診斷HCC準(zhǔn)確性最好[35]。一般使用多個miRNA的相對表達(dá)水平構(gòu)造Logistic回歸模型，計算出預(yù)測概率作為診斷指標(biāo)，也可同時聯(lián)合AFP進(jìn)行診斷試驗。因此，多miRNA聯(lián)合AFP是提高HCC診斷準(zhǔn)確性的有效方法，也將成為miRNA診斷研究的主要方法。

5 結(jié)論及展望

HCC篩查和早期診斷臨床意義重大，隨著對HCC發(fā)病機制研究的持續(xù)深入，大量HCC相關(guān)血清或組織標(biāo)志物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[2]。我們曾嘗試?yán)酶斡捕戎担‵ibroscan）監(jiān)測HCC的發(fā)生，但目前仍在臨床驗證階段，尚需進(jìn)一步多中心臨床研究，驗證其臨床應(yīng)用價值[36]。然而，目前處于研究階段的大量HCC標(biāo)志物，診斷準(zhǔn)確性并不優(yōu)于影像學(xué)方法、AFP，絕大多數(shù)未進(jìn)入臨床[37]。循環(huán)miRNA作為HCC血清學(xué)標(biāo)志物的重要成員，相關(guān)研究方興未艾，由于樣本易獲取、HCC相關(guān)性好、檢測技術(shù)成熟等優(yōu)勢，在HCC早期診斷方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。多種miRNA聯(lián)合診斷可獲得最高診斷效能，且可結(jié)合AFP，可能是將來相關(guān)研究的主要方向。檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)一化是亟待解決的問題，更大樣本、嚴(yán)密設(shè)計的臨床試驗是確定循環(huán)miRNA診斷HCC價值的必要步驟。