·生物技術(shù)與方法·地衣芽胞桿菌FLP/FRT基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建及驗(yàn)證

李宗文，李由然，顧正華，丁重陽，張梁，徐沙，石貴陽

1 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis是一種常見的革蘭氏陽性細(xì)菌，具有耐熱、酶系豐富、產(chǎn)酶量高和安全等諸多優(yōu)良特性，是最具應(yīng)用潛力和價值的芽胞桿菌之一。目前地衣芽胞桿菌被廣泛用于各種蛋白質(zhì)的胞外表達(dá)，包括α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、青霉素酶等，產(chǎn)量可達(dá)25 g/L[1]。此外，地衣芽胞桿菌在飼料添加、醫(yī)藥、環(huán)境治理以及農(nóng)業(yè)病害防治等領(lǐng)域也有重要應(yīng)用[2]。

當(dāng)前以基因組序列信息為藍(lán)圖，基于人工設(shè)計(jì)的遺傳擾動而進(jìn)行的代謝工程已成為研究地衣芽胞桿菌復(fù)雜代謝途徑以及進(jìn)行菌種改造構(gòu)建相關(guān)表型的有效策略。然而，受限于地衣芽胞桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率不高[3]，對其進(jìn)行基因操作存在一定困難，目前文獻(xiàn)報道的幾種基因編輯方法在使用效果上存在多方面的不足。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化敲除盒片段同源替換目標(biāo)基因的方法是實(shí)現(xiàn)微生物基因敲除的經(jīng)典策略，主要通過微生物本身的RecA重組系統(tǒng) (主要包括RecA和RecBCD等蛋白) 發(fā)揮作用[4]。但是受限于地衣芽胞桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率不高，且外源DNA受到限制修飾系統(tǒng)的降解[5]，導(dǎo)致該方法運(yùn)用到地衣芽胞桿菌中敲除效率非常低，而且得到的陽性轉(zhuǎn)化子殘留抗性標(biāo)記[6]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來基因編輯的研究熱點(diǎn)，有報道運(yùn)用CRISPR/Cas9n (Cas9的突變體，單鏈切割) 系統(tǒng)對地衣芽胞桿菌yvmC基因進(jìn)行敲除且效率最高可達(dá)100%[7]。該方法需要將Cas9n基因表達(dá)盒整合到基因組上。還有文獻(xiàn)報道利用溫敏質(zhì)粒介導(dǎo)同源雙交換來失活目標(biāo)基因[8-10]。Nahrstedt等[8]以溫敏質(zhì)粒pE194為載體構(gòu)建敲除質(zhì)粒敲除了地衣芽胞桿菌DNA修復(fù)相關(guān)基因recA和芽胞形成關(guān)鍵基因spoIV來研究解決生物污染問題。該方法的優(yōu)點(diǎn)是把基因敲除分成轉(zhuǎn)化和重組兩個獨(dú)立事件，轉(zhuǎn)化成功后首先大量擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子，之后再進(jìn)行敲除重組過程，因此可以克服傳統(tǒng)方法因遺傳轉(zhuǎn)化效率低導(dǎo)致敲除困難的問題，不足之處是由于敲除盒上沒有設(shè)計(jì)抗性標(biāo)記，會造成篩選工作量很大。因此，綜合上述關(guān)于地衣芽胞桿菌基因編輯方法的現(xiàn)狀，主要有三點(diǎn)不足：一是受限于轉(zhuǎn)化效率不高導(dǎo)致的敲除困難；二是篩選量大；三是殘留抗性標(biāo)記。

FLP/FRT重組系統(tǒng)是發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母2 μm環(huán)狀質(zhì)粒上的位點(diǎn)特異性重組 (Site-specific recombination) 系統(tǒng)，通過FLP重組酶 (Flippase recombination enzyme) 特異性識別FRT位點(diǎn)(FLP recombination target) 可介導(dǎo)2個FRT位點(diǎn)之間DNA片段的刪除、倒位與置換等[11-12]。FLP/FRT重組系統(tǒng)由于具有較高的重組效率和靶向性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母等微生物以及擬南芥、水稻、小鼠、果蠅、線蟲等高等真核模式生物的研究中，實(shí)現(xiàn)了基因敲除、敲入、點(diǎn)突變、缺失突變、染色體組大片段刪除等基因工程操作[13-15]。Sanchez-Martinez等[14]應(yīng)用FLP/FRT系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)在白假絲酵母Candida albicans中刪除抗性標(biāo)記基因URA3和整合外源基因到基因組上。

本研究借助溫敏質(zhì)粒介導(dǎo)基因敲除的策略，在地衣芽胞桿菌中構(gòu)建FLP/FRT基因編輯系統(tǒng)，利用溫敏質(zhì)粒介導(dǎo)敲除的方法克服敲除效率低的問題，敲除盒中間設(shè)計(jì)抗性標(biāo)記解決篩選量大的問題，利用FLP/FRT系統(tǒng)的特異性重組作用解決抗性標(biāo)記殘留問題，并以此成功敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE以及敲入外源透明顫菌血紅蛋白基因vgb，為地衣芽胞桿菌的遺傳改造提供良好的方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒見表1。

1.1.2 主要工具酶、試劑和培養(yǎng)基

文中所用的2×TaqPCR Master Mix、2×PfuPCR Master Mix購自杭州寶賽公司；Fast DigestedTM快速限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo公司；T4 DNA連接酶和pMD19T-simple購于大連TaKaRa公司；卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素購自Sigma公司；質(zhì)粒DNA小劑量提取試劑盒、DNA純化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉購自O(shè)XOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。大腸桿菌和地衣芽胞桿菌生長用LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。配置固體LB時加入1.5%–2.0%的瓊脂粉。在菌株構(gòu)建和搖瓶發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中添加的氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素終濃度分別為100、30、20 μg/mL。

1.1.3 引物

實(shí)驗(yàn)所用引物見表2，引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 敲除及敲入質(zhì)粒的構(gòu)建

敲除質(zhì)粒的構(gòu)建過程如下所述。本研究選取地衣芽胞桿菌9945a α-淀粉酶 (α-amylase) 基因amyL(CP005965 REGION: 723302..724840) 和蛋白酶 (Subtilisin Carlsberg) 基因aprE(CP005965 REGION: 1207540..1208679) 為敲除試驗(yàn)基因。以9945a基因組為模板，分別利用引物amyLXhoⅠ-F/amyL-Hind Ⅲ-R 及aprE-XhoⅠ-F/aprESmaⅠ-R克隆出α-淀粉酶基因amyL及蛋白酶基因aprE，連接到pMD19T-simple上，得到質(zhì)粒19T-amyL及19T-aprE。以質(zhì)粒pMA5為模板，利用引物FRT-KpnⅠ-Kan-F/FRT-SalⅠ-Kan-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到首尾兩端含同向FRT位點(diǎn)的卡那霉素 (Kanamycin，Kan) 抗性基因表達(dá)元件并用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同雙酶切的19T-amyL大片段連接，構(gòu)建得到19T-AFKF(敲除盒片段amyL-FRT-Kan-FRT-amyL，簡稱AFKF)，左右同源臂長分別為420 bp和547 bp。以19T-aprE為模板，利用引物aprE-KpnⅠ-F/aprE-SalⅠ-R反向PCR (引物結(jié)合在aprE基因的中部位置，反向PCR可得到左右同源臂)，PCR產(chǎn)物用KpnⅠ和SalⅠ酶切純化后與卡那霉素抗性基因表達(dá)元件連接，構(gòu)建得到19T-EFKF (敲除盒片段aprE-FRT-Kan-FRT-aprE，簡稱EFKF)，左右同源臂長分別為513 bp和409 bp。最后用XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切19T-AFKF，膠回收敲除盒片段AFKF，連接到相同酶切的pNZTT質(zhì)粒，得到amyL基因的溫敏敲除質(zhì)粒pNZTT-AFKF；XhoⅠ和SmaⅠ酶切19T-EFKF，膠回收敲除盒片段EFKF，連接到相同酶切的pNZTT質(zhì)粒，得到aprE基因的溫敏敲除質(zhì)粒pNZTT-EFKF。

敲入質(zhì)粒的構(gòu)建過程如下所述。文中選取了丙酮酸甲酸裂解酶 (Putative formate C-acetyltransferase)基因pflB(CP005965 REGION: 2135016..2137240)為敲入位點(diǎn)，整合外源透明顫菌血紅蛋白 (Vitreoscillahemoglobin) 基因vgb。首先以9945a基因組為模板，利用引物pflB-SmaⅠ-F/pflB-XhoⅠ-R擴(kuò)增得到pflB基因，連接到pMD19T-simple，構(gòu)建質(zhì)粒19T-pflB。以19T-pflB為模板，利用引物pflB-PstⅠ-R/pflB-BamHⅠ-F反向PCR (引物結(jié)合在pflB基因的中部位置，反向PCR可得左右同源臂)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PstⅠ和BamHⅠ酶切后待用；以pHY300-PLK質(zhì)粒為模板，利用引物FRT-BamHⅠ-Tet-F/FRTPstⅠ-Tet-R擴(kuò)增得到兩端含同向FRT位點(diǎn)的四環(huán)素 (Tetracycline，Tet) 抗性基因表達(dá)元件，經(jīng)BamHⅠ和PstⅠ酶切后與上面的反向PCR產(chǎn)物連接，構(gòu)建質(zhì)粒19T-PFTF。以pWB980-vgb為模板，利用引物vgb-BamHⅠ-F/vgb-BamHⅠ-R擴(kuò)增得到含P43啟動子的vgb表達(dá)盒，BamHⅠ單酶切后連接到相同單酶切的19T-PFTF，構(gòu)建得到質(zhì)粒19T-PFTF-vgb(敲入盒片段pflB-vgb-FRT-Tet-FRT-pflB，簡稱PFTF-vgb)，左右同源臂長分別為935 bp和1 003 bp。最后用SmaⅠ和XhoⅠ酶切19T-PFTF-vgb得到敲入盒PFTF-vgb，連接到相同酶切的pNZTK質(zhì)粒，得到溫敏敲入質(zhì)粒pNZTK-PFTF-vgb。

表2 文中所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2 FLP重組酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pCP20為模板，利用引物flp-SmaⅠ-F/flp-SmaⅠ-R擴(kuò)增出FLP重組酶結(jié)構(gòu)基因flp，擴(kuò)增產(chǎn)物flp經(jīng)SmaⅠ單酶切后純化待用。質(zhì)粒pMA5經(jīng)NdeⅠ酶切純化后用等量的2×PfuDNA聚合酶72 ℃孵育15 min補(bǔ)平粘性末端，然后與flp連接，構(gòu)建中間質(zhì)粒pMA5-flp。以pMA5-flp為模板，利用引物flp-pMA-SmaⅠ-F/flp-pMAXhoⅠ-R擴(kuò)增得到含HpaⅡ啟動子的flp表達(dá)盒，flp表達(dá)盒與pNZTT經(jīng)過相同的SmaⅠ和XhoⅠ酶切后連接得到pNZTT-flp，與pNZTK經(jīng)相同的SmaⅠ和XhoⅠ酶切后連接得到pNZTK-flp。為行文方便，稱pNZTT-flp為敲除消抗質(zhì)粒，稱pNZTK-flp為敲入消抗質(zhì)粒。

1.2.3 基因敲除與基因敲入

基因敲除步驟如下所示。以敲除amyL為例，把構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒pNZTT-AFKF通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入地衣芽胞桿菌9945a細(xì)胞中。電轉(zhuǎn)方法參考李由然[16]，特別地，種子需經(jīng)LB平板活化，菌體要充分洗滌4次以盡可能除去離子以及質(zhì)粒加入量不少于200 ng。轉(zhuǎn)化成功的9945a/pNZTTAFKF首先在30 ℃、200 r/min下增殖活化，形成足夠的新鮮菌濃；轉(zhuǎn)接300 μL菌液至新的15 mL LB培養(yǎng)基，42 ℃、250 r/min無抗培養(yǎng)1代，培養(yǎng)時間約14–20 h；用接種環(huán)蘸取菌液在卡那霉素抗性平板上劃線，平板置于37 ℃培養(yǎng)箱至長出單菌落，經(jīng)PCR驗(yàn)證得到單交換菌株；單交換菌株先在37 ℃搖瓶擴(kuò)增，后轉(zhuǎn)接150 μL單交換菌液至新的15 mL LB培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min無抗培養(yǎng)2代，每代培養(yǎng)時間約24–30 h；最后用無菌水稀釋10–5–10–6涂布卡那霉素抗性平板，平板置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長出單菌落。挑取一定數(shù)量的單菌落在卡那霉素抗性平板上劃線擴(kuò)增，然后一一對應(yīng)劃線至四環(huán)素抗性平板，在四環(huán)素抗性平板上不長的單菌落符合敲除重組子抗性特征，用敲除驗(yàn)證引物amyL-F/amyL-M-R、amyL-M-F/amyL-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。同樣的流程用溫敏敲除質(zhì)粒pNZTT-EFKF對蛋白酶基因aprE進(jìn)行敲除。

基因敲入的原理是在敲除質(zhì)粒的基礎(chǔ)上在同源臂和同側(cè)FRT位點(diǎn)之間插入外源基因，然后經(jīng)過與敲除相同的操作流程，可實(shí)現(xiàn)外源基因整合至基因組。具體為：把構(gòu)建好的敲入質(zhì)粒pNZTKPFTF-vgb通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入地衣芽胞桿菌9945a中，然后經(jīng)過與敲除相同的變溫傳代過程，最后抗性平板篩選出具有卡那霉素抗性，同時對四環(huán)素敏感的，并用敲入驗(yàn)證引物pflB-F/pflB-M-R、pflB-M-F/pflB-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.4 抗性回收

前面得到的敲除重組子與敲入重組子基因組上都插入了抗性標(biāo)記基因，使得菌體帶有抗性?？剐曰厥詹呗允峭ㄟ^電轉(zhuǎn)的方法向重組子中導(dǎo)入一個FLP重組酶表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)的FLP重組酶特異性識別FRT位點(diǎn)并介導(dǎo)2個FRT位點(diǎn)之間抗性基因的刪除。其中敲除重組子導(dǎo)入pNZTT-flp，敲入重組子導(dǎo)入pNZTK-flp，然后在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2代，最后抗性平板負(fù)篩出抗性丟失的重組菌，并用相應(yīng)引物進(jìn)行菌落PCR鑒定并測序驗(yàn)證。

抗性回收后攜帶消抗質(zhì)粒的重組菌在37 ℃下無抗搖瓶傳代2次即可丟失質(zhì)粒。

1.2.5 α-淀粉酶及蛋白酶酶活檢測

淀粉酶酶活的測定參照Kim等[17]的方法進(jìn)行。酶活單位 (U) 定義為：在40 ℃、pH 6.5的反應(yīng)條件下，1 mL酶液每小時分解可溶性淀粉生成麥芽糖的μmol數(shù)。

蛋白酶酶活采用Folin 酚法[18]測定。酶活單位(U) 定義為：在40 ℃、pH 10.0條件下，1 mL酶液每分鐘水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活單位。

1.2.6 vgb整合表達(dá)檢測

運(yùn)用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取9945a.4總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再設(shè)計(jì)vgb特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR (real-time PCR, RT-PCR)分析檢測，以核糖體S5蛋白基因rpsE[19-20]為內(nèi)參，根據(jù)基因達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù) (Ct值)，采用2–△Ct法計(jì)算vgb基于內(nèi)參基因rpsE的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除質(zhì)粒及敲入質(zhì)粒的構(gòu)建

將構(gòu)建得到的敲除質(zhì)粒pNZTT-AFKF用Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切，結(jié)果如圖1A所示，所得條帶大小與理論值2 209 bp和5 672 bp相符，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確；pNZTT-EFKF用SmaⅠ和XhoⅠ酶切并進(jìn)行核酸膠電泳，結(jié)果如圖1B所示，兩條帶大小與理論值2 175 bp和5 329 bp相符，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

類似地，將構(gòu)建得到的敲入質(zhì)粒pNZTKPFTF-vgb用Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切，結(jié)果如圖1C所示，目的條帶大小與理論值3 320 bp和6 183 bp相符，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

所有構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證無序列突變。

2.2 FLP重組酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建得到的FLP重組酶表達(dá)質(zhì)粒pNZTT-flp經(jīng)SmaⅠ和XhoⅠ酶切，結(jié)果如圖2A所示，條帶大小與理論值1 760 bp和5 329 bp相符，表明敲除消抗質(zhì)粒pNZTT-flp構(gòu)建正確。flp表達(dá)盒經(jīng)測序驗(yàn)證無序列突變。

同理，pNZTK-flp用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和XhoⅠ酶切，結(jié)果如圖2B所示，兩條帶大小與理論值1 760 bp和4 852 bp相符，表明敲入消抗質(zhì)粒pNZTK-flp構(gòu)建正確。flp表達(dá)盒經(jīng)測序驗(yàn)證無序列突變。

2.3 amyL及aprE基因的敲除及抗性回收

文中所用的pNZT1質(zhì)粒是溫度敏感型滾環(huán)復(fù)制質(zhì)粒，屬于大腸桿菌-芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒，培養(yǎng)溫度在30 ℃及以下時可穩(wěn)定復(fù)制，37 ℃及以上質(zhì)粒丟失[21]。pNZT1攜帶有紅霉素抗性基因，但由于紅霉素對文中宿主菌實(shí)際應(yīng)用效果不好，因此在多克隆位點(diǎn)的NotⅠ處插入卡那霉素抗性基因表達(dá)盒得到pNZTK質(zhì)粒，插入四環(huán)素抗性基因表達(dá)盒得到pNZTT質(zhì)粒。插入的抗性基因作為載體自身的抗性使用。

基因敲除原理是兩步同源重組作用[9,21-22]。以敲除amyL為例，9945a/pNZTT-AFKF首先在30 ℃下增殖活化，目的是為了獲得生長旺盛的含敲除質(zhì)粒的菌液及足夠的菌濃；菌液轉(zhuǎn)接到42 ℃無抗培養(yǎng)，此溫度下質(zhì)粒無法復(fù)制，敲除質(zhì)粒攜帶的一側(cè)同源臂和amyL基因的同源序列之間發(fā)生同源重組，使得整個敲除質(zhì)粒線性整合到基因組上，此過程稱為單交換，單交換菌株具有卡那霉素和四環(huán)素雙重抗性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此步驟也有可能直接得到雙交換菌株。得到的單交換菌株轉(zhuǎn)接至30 ℃下無抗培養(yǎng)，此時低溫誘導(dǎo)復(fù)制子發(fā)生滾環(huán)復(fù)制使質(zhì)粒部分從基因組上切下，同時敲除盒的另一側(cè)同源臂和amyL基因的同源序列之間發(fā)生同源重組，此過程稱為雙交換，雙交換菌株只有卡那霉素抗性。通過兩次同源交換，amyL基因被敲除質(zhì)粒pNZTT-AFKF上的敲除盒同源替換，導(dǎo)致amyL缺失及插入失活。敲除原理[21]及抗性回收示意圖見圖3。

圖1 敲除質(zhì)粒pNZTT-AFKF (A)、pNZTT-EFKF (B) 及敲入質(zhì)粒pNZTK-PFTF-vgb (C) 的酶切驗(yàn)證Fig.1 Identification of knock-out vector pNZTT-AFKF (A), pNZTT-EFKF (B) and knock-in vector pNZTK-PFTF-vgb(C).(A) M: DL 10 000 DNA marker; lane 1: digested by XhoⅠ and Hind Ⅲ.(B) M: DL 10 000 DNA marker; lane 1:digested by SmaⅠand XhoⅠ.(C) M: DL 10 000 DNA marker; lane 1: digested by XhoⅠand Hind Ⅲ.

圖2 敲除消抗質(zhì)粒pNZTT-flp (A) 及敲入消抗質(zhì)粒pNZTK-flp (B) 的酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of marker recycling vectors pNZTT-flp (A) and pNZTK-flp (B).M: DL 10 000 DNA marker; lane 1: digested by XhoⅠand SmaⅠ.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除質(zhì)粒pNZTT-AFKF通過單交換方式線性整合至9945a基因組上屬于高概率事件，效率高達(dá)90%以上。取低溫培養(yǎng)后的雙交換菌液用無菌水稀釋10–6涂卡那霉素抗性平板，從長出的單菌落中均勻挑取28個單菌落，四環(huán)素抗性平板負(fù)篩到22株對四環(huán)素敏感，表明雙交換的效率為78.6% (圖4)。從中任意挑8株用敲除驗(yàn)證引物amyL-F/amyL-M-R和amyL-M-F/amyL-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5A所示，PCR條帶大小均和理論相符，而原始菌沒有條帶，說明amyL基因被成功敲除，敲除重組子命名為9945a.1。從中任意挑選一株9945a.1提基因組作為模板，用引物amyL-F/amyL-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果和理論相符。

圖3 amyL敲除原理[21]及FLP/FRT系統(tǒng)介導(dǎo)的抗性回收示意圖Fig.3 Scheme of deletion amyL[21] and marker recycling by FLP/FRT system.Note that the initial recombination can occur either in the upstream portion of the target gene as shown here, or at the downstream portion.In both cases the final structure of the chromosome is the same.

圖4 amyL敲除雙交換抗性篩選Fig.4 The resistance screening of double crossover for amyL knock-out.(A) Kanr plate.(B) Tetr plate.The colonies between plate A and plate B are corresponding one by one.

圖5 amyL突變株9945a.1和9945a.2的菌落PCR驗(yàn)證Fig.5 Identification of the 9945a.1 and 9945a.2 by colony PCR.(A) M: molecular mass marker; 0L–8L: PCR products using primers amyL-F/amyL-M-R; 0R–8R: PCR products using primers amyL-M-F/amyL-R.Among the lanes, 1L–8L and 1R–8R took genome of 9945a.1 as a template, 0L and 0R act the contrast whose templates were 9945a.The sizes of PCR products are shown in Fig.3.(B) M: molecular mass marker; lane 1: PCR product of 9945a using primers amyL-F/amyL-R, 1 901 bp；lane 2: PCR product of 9945a.1 using primers amyL-F/amyL-R, 2 603 bp; lane 3 and lane 4:PCR products of 9945a.2 using primers amyL-F/amyL-R, 1 417 bp.

對9945a.1進(jìn)行抗性回收，在四環(huán)素抗性平板上挑選了30個單菌落，一一對應(yīng)劃線至卡那霉素平板上篩選到24株卡那霉素抗性丟失，抗性回收效率高達(dá)80%。任意挑選2株對卡那霉素敏感的菌落用引物amyL-F/amyL-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖5B，抗性回收后條帶大小為1 417 bp，明顯小于原始菌的1 901 bp和抗性回收前的2 603 bp，說明抗性回收成功。抗性回收后的敲除重組菌命名為9945a.2。任意挑取1株9945a.2提基因組作為模板，用引物amyL-F/amyL-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果和理論相符。

9945a.2含有質(zhì)粒pNZTT-flp，經(jīng)過37 ℃無抗傳代2次可得到質(zhì)粒丟失的無抗單菌落。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證敲除系統(tǒng)的可行性及敲除效率，還對9945a.2進(jìn)行了蛋白酶基因aprE的敲除。aprE的敲除原理和操作流程與amyL相同，第一步高溫培養(yǎng)下pNZTT-EFKF通過單交換方式線性整合至基因組，此步驟效率高于50%；第二步低溫培養(yǎng)誘導(dǎo)單交換菌株發(fā)生雙交換，從挑選的18株單菌落中篩選到14株具有卡那霉素抗性而對四環(huán)素敏感 (圖6A和6B)，表明雙交換效率為77.7%。對雙交換成功的aprE敲除重組子命名為9945a.3。同樣地，對9945a.3通過電轉(zhuǎn)方法導(dǎo)入消抗質(zhì)粒pNZTT-flp進(jìn)行了抗性回收，并用引物aprE-XhoⅠ-F/aprE-SmaⅠ-R進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖6C所示，原始菌條帶大小為1 116 bp，消抗前為2 185 bp，抗性回收后為 999 bp?？剐曰厥蘸蟮闹亟M菌命名為9945a.4。

圖6 aprE敲除雙交換抗性篩選及抗性回收PCR驗(yàn)證Fig.6 The resistance screening of double crossover for aprE knock-out and identification of marker recycling by PCR.(A) Kanr plate.(B) Tetr plate.The colonies between plate A and plate B are corresponding one by one.(C) M: DL 10 000 DNA marker; lane 1: PCR product of 9945a, 1 116 bp; lane 2: PCR product of 9945a.3, 2 185 bp; lane 3: PCR product of 9945a.4, 999 bp.All PCR products used primers aprE-XhoⅠ-F/aprE-SmaⅠ-R.

2.4 vgb基因的敲入及抗性回收

基因敲入的原理是在敲除質(zhì)粒的基礎(chǔ)上在同源臂和同側(cè)FRT位點(diǎn)之間插入外源基因，然后經(jīng)過與敲除相同的重組過程，最后可實(shí)現(xiàn)外源基因在基因組上的定點(diǎn)敲入。結(jié)果顯示，敲入質(zhì)粒pNZTK-PFTF-vgb通過單交換線性整合至9945a基因組的概率高達(dá)95%以上，屬于非限速步驟。取低溫培養(yǎng)后的雙交換菌液稀釋10–6涂四環(huán)素平板，從長出的單菌落中均勻挑取了30個單菌落，經(jīng)篩選有27株對卡那霉素敏感，如圖7所示，雙交換的效率為90%。從中任意挑8株用敲入驗(yàn)證引物pflB-F/pflB-M-R和pflB-M-F/pflB-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖8A所示，8株菌均成功敲入，即pflB基因被敲除，同時vgb整合至pflB位點(diǎn)。vgb基因敲入重組子命名為9945a.5。

圖7 vgb敲入雙交換抗性篩選Fig.7 The resistance screening of double crossover for vgb knock-in.(A) Tetr plate.(B) Kanr plate.

任意挑選1株9945a.5導(dǎo)入消抗質(zhì)粒pNZTKflp進(jìn)行抗性回收，篩選得到對四環(huán)素敏感的單菌落，用引物pflB-F/pflB-R進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果如圖8B所示?？剐曰厥涨皵U(kuò)增產(chǎn)物長5 101 bp，回收后為3 525 bp，圖8B條帶小于4 000 bp，表明抗性回收成功，抗性回收后的重組菌命名為9945a.6。

2.5 α-淀粉酶及蛋白酶酶活檢測

amyL突變株9945a.2 α-淀粉酶酶活檢測以地衣芽胞桿菌9945a原始菌為對照，結(jié)果如圖9A所示，9945.2的淀粉酶比酶活只有原始菌的4.7%左右，酶活大幅度減少，這也證實(shí)了amyL基因被敲除。據(jù)文獻(xiàn)分析，殘余的酶活可能是來自其他淀粉酶比如Taka-淀粉酶 (Taka-amylase)[23]或普魯蘭酶[16]。aprE敲除后蛋白酶比酶活由原始菌的16.3 U/mg減少到3.2 U/mg，減少了80.4%；淀粉酶基因的敲除對菌株產(chǎn)蛋白酶幾乎無影響。

圖8 vgb敲入突變株P(guān)CR驗(yàn)證及敲入策略示意圖Fig.8 Identification of the 9945a.5 and 9945a.6 by PCR and the strategy of knocking in vgb.(A) M: DL 10 000 DNA marker; 1L–8L: PCR products of 9945a.5 using primers pflB-F/pflB-M-R; 1R–8R: PCR products of 9945a.5 using primers pflB-M-F/pflB-R.The sizes of PCR products are shown in Fig.8C.(B) M: DL 10 000 DNA marker; lane 1 and lane 2: PCR products of 9945a.6 using primers pflB-F/pflB-R, 3 525 bp.(C) Brief scheme of knocking in vgb and marker recycling by FLP/FRT system.Note that basic principle of knocking in a heterogenous gene is the same with deletion a gene like amyL, except for carrying a heterogenous gene between a homology arm and the same side FRT.

圖9 敲除突變株α-淀粉酶 (A) 及蛋白酶 (B) 酶活檢測Fig.9 Activities of α-amylase (A) and protease (B) of the knock-out mutants and wide type.

2.6 vgb表達(dá)檢測

vgb基因編碼透明顫菌血紅蛋白VHB，VHB受氧濃度調(diào)控，在貧氧條件下可維持菌的生長。vgb的RT-PCR檢測結(jié)果如表3所示，9945a.6中檢測到vgb的表達(dá)，且相對rpsE的表達(dá)量為1.23，表達(dá)水平相對較高，這可能是由于vgb的啟動子P43是組成型的強(qiáng)啟動子，而原始菌9945a中未檢測到vgb的表達(dá)，說明外源的vgb成功整合至基因組且得到表達(dá)。

表3 vgb敲入菌株9945a.6及原始菌rpsE和vgb表達(dá)水平分析Table 3 Relative mRNA abundance of rpsE and vgb in 9945a.6 and the wide type

3 討論

地衣芽胞桿菌作為極具應(yīng)用潛力的工業(yè)菌種之一，限制其應(yīng)用進(jìn)一步拓展的因素之一就是基因操作困難。轉(zhuǎn)化敲除盒片段直接進(jìn)行雙交換的一步法在轉(zhuǎn)化效率不高的條件下很難得到陽性轉(zhuǎn)化子。本研究借鑒了溫度敏感型質(zhì)粒進(jìn)行基因敲除的成功案例，首次結(jié)合運(yùn)用FLP/FRT重組系統(tǒng)，構(gòu)建出一套適用于地衣芽胞桿菌的、更加實(shí)用的基因編輯系統(tǒng)。運(yùn)用該系統(tǒng)高效敲除了地衣芽胞桿菌α-淀粉酶基因amyL及蛋白酶基因aprE；實(shí)現(xiàn)了外源基因vgb在基因組上的成功敲入與表達(dá)。本方法是對已有溫敏質(zhì)粒介導(dǎo)基因敲除技術(shù)的有機(jī)延伸與拓展。原技術(shù)由于插入位點(diǎn)不帶抗性標(biāo)記，需要多步傳代富集陽性轉(zhuǎn)化子，且依靠無抗平板初篩，工作量大。本方法在預(yù)先引入FRT重組位點(diǎn)的前提下，利用設(shè)計(jì)于插入位點(diǎn)的抗性標(biāo)記，顯著縮短了陽性轉(zhuǎn)化子篩選周期及減少篩選工作量；結(jié)合FLP重組酶介導(dǎo)的高效率抗性回收，同樣達(dá)到了無抗性標(biāo)記殘留的基因編輯。在地衣芽胞桿菌常用抗生素有限的背景下，僅需單一抗性標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)多基因的連續(xù)敲除。

另一方面，該系統(tǒng)還存在一個Cre-loxP和FLP/FRT系統(tǒng)普遍存在的問題，即每一次運(yùn)用該系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除，都會在基因組上留下1個FRT識別位點(diǎn)的疤痕，因此如果對基因組進(jìn)行多輪操作，留下的多個識別位點(diǎn)之間可能會發(fā)生重組，降低基因組的穩(wěn)定性。為了避免這種情況，后續(xù)可參考Yan等[24]使用突變型的FRT位點(diǎn)[25]，從而提高遺傳穩(wěn)定性。

總體來說，文中構(gòu)建的FLP/FRT基因編輯系統(tǒng)能夠有效地在地衣芽胞桿菌中敲除目標(biāo)基因以及敲入外源基因，為地衣芽胞桿菌的代謝改造及基因功能研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)方法。有文獻(xiàn)表明[21-22]，溫敏質(zhì)粒介導(dǎo)的基因敲除方法也可運(yùn)用到遺傳轉(zhuǎn)化困難的其他芽胞桿菌中，因此可推測本研究成果在芽胞桿菌中具有一定的通用性。