金屬蛋白酶家族系主要基因位點多態(tài)性與缺血性腦血管病的相關(guān)性分析

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基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloprotease，MMPs)是一組含可降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白酶，導(dǎo)致血管內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白含量改變及血管重構(gòu)。MMPs破壞血管基質(zhì)和腦血管完整性進而損傷血腦屏障，導(dǎo)致腦損傷進一步加重，其認(rèn)為是腦血管病發(fā)病過程重要的因子[1]。近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9不同基因型對大動脈粥樣硬化作用不同，Peigne等[2]研究結(jié)果顯示：SNP(rs391242，C-1562T)T純合子及雜合子較C/C純合子更能誘導(dǎo)proMMP-9合成，增強MMP-9活性，通過血管重構(gòu)增加腦動脈硬化程度，同時發(fā)現(xiàn)T純合子及雜合子人群與C/C純合子人群相比動脈僵硬度顯著增加，橈動脈及頸動脈收縮壓及脈壓顯著升高。本研究分析不同組別病人MMP-1/C-161T、MMP-9/C1562T和MMP-3啟動子SNP-1171基因型和等位基因頻率的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月—2017年3月于我院就診的短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)病人100例作為TIA組，同時選取腦梗死病人100例為卒中組。同時納入我院健康體檢者100名為對照組。TIA組，男56例，女44例；年齡45～62(53.1±12.3)歲；卒中組，男58例，女42例；年齡47～69(54.1±12.9)歲；對照組，男52名，女48名；年齡44～71(55.1±11.8)歲。3組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 各組納入及排除標(biāo)準(zhǔn) TIA組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合TIA診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡>40歲；③排除其他腦部血管性疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。TIA診斷標(biāo)準(zhǔn)：局部神經(jīng)癥狀和體征發(fā)病24 h內(nèi)(多數(shù)1 h內(nèi))完全消失；發(fā)作急速(2～3 min)；符合TIA發(fā)作時神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和體征。卒中組納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)符合急性腦血管??；②發(fā)病2周之內(nèi)；③頭顱CT、MRI確診為急性腦血管??；④既往無明確腦血管病史；⑤年齡≥40歲；⑥排除其他腦部血管性疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥40歲；②排除腦血管病、惡性腫瘤、其他自身免疫性疾病等。

1.3 MMP-1、MMP-3和MMP-9基因型測定方法 MMP-1基因型測定，①DNA提取與擴增：采用酚-氯仿抽提法由外周血有核細(xì)胞提取基因組DNA，運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增PPAR-γ2基因Pro12Ala多態(tài)性片段。上游引物序列(F):5′-CAAGCCCAGTCCTTTCTGTG-3′；下游引物序列(R)5′-AGTGAAGGAATCGC TTTCCG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變5 min，95 ℃變性45 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)，末次循環(huán)72 ℃ 7 min。反應(yīng)在PCR擴增儀上完成(美國Bio-Rad生產(chǎn))。②多態(tài)性檢測：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)方法，PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅡ(美國Promegar公司生產(chǎn))酶切，酶切位點為C/C GG。37 ℃水欲酶解4 h，經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色后讀取基因型。MMP-3基因型測定：MMP-3基因rs3025058位點基因新包括5A純合子、6A純合子、5A/6A雜合子?；蛐蜋z測方法同上。上游引物序列(F):5′-CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT-3′；下游引物序列(R)5′-TTCCCCCATEAAAGGAATGGAGAACC-3′。MMP-9基因型測定，①基因組DNA的提?。喝DTA抗凝血3 mL，采用飽和酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。②MMP-9基因C21562T多態(tài)性檢測：應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)。引物序列參考文獻設(shè)計，由上海生化生物工程公司合成，上游引物：5′-GCCTGGCACATAGATGGCCC-3′；下游：5′-CTTCCTA GCCAGCCGGCATA-3′。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA100 ng，KCl 50 mmol/L， tris-HCl 10 mmol/L，pH 8.3，MgCl22.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、TaqDNA聚合酶1 U，上下游引物各0.5 mol/L。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，進行35個循環(huán)，最后一次循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用Sph I酶切，37 ℃消化過夜，酶切產(chǎn)物行3.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察結(jié)果、攝片。所有參與研究對象均簽署知情同意書。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用Fisher′s檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組MMP-1/c-161T基因型和等位基因頻率比較 在C-161T位點上，野生CC組，雜合子CT及突變純合TT上TIA組和卒中組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TIA組和腦卒中組等位基因上C基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 3組MMP-1/c-161T基因型和等位基因頻率比較

與對照組比較，1)P<0.05

注：M為模板DNA；1、2為CC純合性；3、4為CT雜合性；5、6為TT純合型

2.2 3組MMP-9/C1562T基因型和等位基因頻率比較 3組純合型CC、雜合子(CT)和純合突變型TT3種基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖2。

表2 3組MMP-9/C1562T基因型和等位基因頻率比較

注：M為模板DNA；1-4、6為CC基因型；5為CT基因型；7為TT基因型

2.3 3組MMP-3啟動子SNP-1171基因型和等位基因頻率比較 3組MMP-3啟動子SNP-1171在rs3025058點位上三種基因型(5A/5A、5A/6A和6A/6A)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3、圖3。

表3 3組MMP-3啟動子SNP-1171基因型和等位基因頻率比較

注：2、3、4、7和9為6A/6A純合子；5和6為5A/6A為雜合子；8為5A/5A純合子

3 討 論

在我國，隨著老齡化社會的到來和生活方式的改變，腦血管病已成為第一位致死原因[3]。MMPs是一組能降解ECM的蛋白酶，根據(jù)結(jié)構(gòu)和底物特異性不同分為間質(zhì)膠原酶(MMP-1、MMP-2、MMP-13、MMP-18)、Ⅵ型膠原酶、明膠酶(MMP-2、MMP-9)、基質(zhì)溶解素(MMP-3、MMP-7、MMP-10)等，與腦血管病發(fā)病密切相關(guān)[4]。由于MMPs可導(dǎo)致血管重構(gòu)，認(rèn)為在血管疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用。近年來，MMPs特別是MMP-9在腦缺血損傷作用日益受到重視[5]。由于MMPs能破壞血管基質(zhì)和血管的完整性，損傷血腦屏障，導(dǎo)致腦損傷進一步加重，認(rèn)為是腦血管病發(fā)病過程的重要因子[6-7]。MMP-3是MMP家族中的一種關(guān)鍵酶，能影響其他MMPs的活性和作用，在保持大血管內(nèi)基質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[8]，其單核苷酸多態(tài)性研究表明，SNP(rs3025058，5A/6A)與冠狀動脈粥樣硬化程度及心肌梗死的危險性密切相關(guān)[9-10]。有報道顯示，MMP-1是金屬蛋白酶家族表達(dá)相對較高的腸膠原酶，能降解人體內(nèi)豐富的Ⅰ型和Ⅲ型膠原組織。動物研究顯示，該基因可加快動脈粥樣硬化過早進入不穩(wěn)定狀態(tài)[11-13]。本研究結(jié)果可見，TIA組和卒中組與對照組MMP-1/c-161T基因型和等位基因頻率情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TIA組和卒中組與對照組MMP-9/C1562T基因多態(tài)性和基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。分析該基因與缺血性腦血管疾病可能不存在相關(guān)性，該結(jié)果有待進一步研究。相關(guān)資料顯示，MMP-9與血管彈性密切相關(guān)，認(rèn)為管腔內(nèi)壓力高誘導(dǎo)MMPs直接參與頸動脈粥樣硬化的加重過程，MMP-9在高血壓病早期血管重構(gòu)中起重要作用[14-15]。本研究TIA組和卒中組與對照組MMP-3啟動子SNP-1171基因型和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。部分研究資料顯示，血管組織MMP-3水平及蛋白水平在5A純合子表達(dá)最高，在6A純合子中表達(dá)最低，5A純合子人群與5A/6A雜合子及6A純合子相比，動脈粥樣硬化程度顯著增加，患高血壓病的發(fā)病率明顯增高[16-17]。該基因與缺血性腦血管病的相關(guān)性值得進一步研究和證實。

綜上所述，MMP-1基因多態(tài)性可能與缺血性腦血管疾病相關(guān)，但本研究中未發(fā)現(xiàn)MMP-3和MMP-9基因多態(tài)性與缺血性腦血管病存在明顯相關(guān)性，有待進一步研究。