巨噬細胞對單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠腎纖維化的影響

吳清鳳，孫世仁，陳陽，寧曉暄*

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1老年病科，2腎臟內(nèi)科，西安 710032)

近年來，發(fā)生慢性腎臟病(chronic kidney diseases，CKD)的老年人數(shù)逐年增加，并且CKD的病因明確困難，現(xiàn)有的治療手段效果又不佳，因此CKD已成為老年人健康的巨大威脅[1]。腎纖維化是各種CKD進展至終末期腎臟疾病(end-stage renal disease，ESRD)的共同通路[2]。炎性因子在腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用，其與腎小管上皮間質(zhì)及內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化，周細胞、系膜細胞及成纖維細胞激活相關(guān)[3]。曾有研究表明巨噬細胞是參與腎臟炎癥反應(yīng)的主要細胞，因其具有強可塑性，參與腎纖維化整個進程。研究發(fā)現(xiàn)在不同的腎臟微環(huán)境下巨噬細胞可活化為不同的表型：即經(jīng)典激活的M1型巨噬細胞和選擇激活的M2型巨噬細胞[4]。不同表型的巨噬細胞通過分泌不同細胞因子發(fā)揮抗炎、促炎及促進組織重塑作用[5]。據(jù)報道M1型巨噬細胞主要參與固有免疫應(yīng)答，分泌促炎因子加重腎損傷，啟動腎纖維化[6]；M2型巨噬細胞通過分泌促纖維化因子參與損傷組織的修復(fù)和重塑[7]。但最新研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞還具促纖維化作用[8]，同時有研究報道減少M2型巨噬細胞可減輕腎臟纖維化[9]。因此，不同極化類型的巨噬細胞在腎臟纖維化中的作用仍存在爭議。為此，我們檢測了單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureter obstruction,UUO)腎纖維化模型中巨噬細胞的極化類型，為深入研究巨噬細胞在腎纖維化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物模型及取材

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級8周齡雄性C57BL/6J小鼠39只(空軍軍醫(yī)大學(xué)動物中心)，采用隨機數(shù)表法完全隨機分為4組。麻醉小鼠后，用膠帶固定四肢，局部剃毛，左側(cè)下腹部切口約0.5 cm，依次切開皮膚至腹膜后，用鑷子游離輸尿管，用組織鉗將左側(cè)輸尿管中段部位鉗起，穿插進一段縫合線，分別在近腎臟及膀胱側(cè)結(jié)扎，從兩結(jié)扎線間剪斷輸尿管，然后連續(xù)縫合肌肉層，間斷縫合皮膚。假手術(shù)組(sham組)除不結(jié)扎輸尿管外，其余處理同模型組。模型組小鼠分別于UUO術(shù)后3 d(UUO-3d組)、7 d(UUO-7d組)、14 d(UUO-14d組)腹腔注射水合氯醛麻醉，用生理鹽水經(jīng)左心室灌注至腎臟發(fā)白，取下左側(cè)腎臟，沿腎門縱切，一半腎臟做流式細胞術(shù)分析，另一半腎臟存于4%多聚甲醛中固定，脫水后石蠟包埋待切片。

1.2 病理染色

1.2.1 HE染色 將切片依次放入二甲苯 Ⅰ、Ⅱ 各20 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，75%乙醇5 min脫蠟。將切片放入蘇木素染液3～5 min，自來水洗1次，分化液分化，返藍液返藍，流水沖洗。梯度乙醇脫水，伊紅染液染色5 min。無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min脫蠟，中性樹膠封片。每組隨機選取3個樣本，每個樣本隨機選取3個視野，顯微鏡檢查，采用 Image-Pro Plus 6.0軟件計算腎間質(zhì)藍色顆粒(炎性細胞)數(shù)量，計算平均值。

1.2.2 Masson染色 切片脫蠟步驟同HE染色，重鉻酸鉀浸泡過夜，自來水洗1次；鐵蘇木素染液染色3 min，自來水洗1次，分化液分化，返藍液返藍，流水沖洗。麗春紅浸染10 min，自來水漂洗，磷鉬酸溶液浸染1～3 min,苯胺藍染液染3～6 min，1%冰醋酸分化，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min脫蠟，中性樹膠封片。每組隨機選取3個樣本，每個樣本隨機選取 3個視野，顯微鏡檢查，采用 Image-Pro Plus 6.0軟件計算，腎間質(zhì)藍色區(qū)域為膠原纖維。

1.3 免疫熒光染色

將固定于4%多聚甲醛中的腎組織取出,放入30%蔗糖溶液脫水OCT包埋，-80℃冰箱冷凍4 h后切片,厚度約4 μm。稀釋的第一抗體[F4/80(巨噬細胞標志物),ab6640,10 μg/ml，于4℃用微量離心機以13 500g離心2 min]孵育過夜。稀釋的第二抗體(Cy3-山羊抗大鼠,1∶300稀釋)孵育1 h。細胞核標志物DAPI(貨號ServicebioG1012)1∶300稀釋;封片避光-80℃保存。熒光顯微鏡觀察，每組隨機選取3個樣本，每個樣本隨機選取 3個視野，采用 Image-Pro Plus 6.0軟件計算腎間質(zhì)紅色熒光和藍色熒光merge的細胞，即巨噬細胞的數(shù)量，計算平均值。

1.4 流式細胞術(shù)

將腎臟剪碎(約1 mm×1 mm×1 mm 大小)放入1×Hank′s 液(含1 mg/ml Ⅳ型膠原酶)中,37℃搖床消化30 min,取出消化好的細胞懸液,加入2 倍體積含5%血清的 1640 培養(yǎng)基終止消化,70 μm 尼龍膜過濾,15 ml 離心管收集細胞懸液,離心(50 g,4℃,5 min),取上清,重復(fù)3次,再離心(1 300 轉(zhuǎn)/min,4℃,5 min),加1 ml 裂紅液,裂紅5 min,加12 ml 流式液(1×PBS 含5%胎牛血清,4%疊氮鈉)終止裂紅,離心(1 300轉(zhuǎn)/min,4℃,5 min),用1 ml 流式液重懸細胞,計數(shù)后,按1×106細胞/管量分裝到流式管中,離心(1 300轉(zhuǎn)/min,4℃,5 min),去上清,10 μl 大鼠血清封閉30 min, 加入抗體[PE-CD86(M1型巨噬細胞標志物),FITC-F4/80]避光孵育30 min,流式液洗滌,加入400 μl PBS 重懸,準備上機。加FITC-F4/80避光孵育30 min后,流式液洗滌,加入500 μl固定液固定30 min,1 ml破膜液洗2 遍,PE-CD206(M2型巨噬細胞標志物) 避光孵育30 min,流式液洗滌,加入400 μl PBS 重懸,準備上機。用Flow Jo軟件分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化

假手術(shù)組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)改變無明顯差異，腎間質(zhì)無炎性細胞浸潤，無膠原蛋白沉積。與假手術(shù)組相比，3個模型組小鼠腎間質(zhì)炎性細胞浸潤均增多[(169±16)vs(1 068±164)，(2 159±432)，(3 536±318)，P<0.05]，膠原蛋白沉積面積均增加[(7.8±1.5)%vs(14.1±2.7)%，(27.4±3.1)%，(39.3±2.7)%，P<0.05]，且隨UUO術(shù)后時間延長，腎間質(zhì)炎性細胞及膠原蛋白沉積增加越多(P<0.05，圖1)。

2.2 各組小鼠腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤情況

與假手術(shù)組相比，UUO-3d模型組中腎臟每高倍鏡視野下巨噬細胞數(shù)量顯著增加[(2.00±1.21)vs(8.00±2.54),P<0.05]，UUO-7d模型組腎臟巨噬細胞較UUO-3d模型組巨噬細胞比例增加[(8.00±2.54)vs(18.00±2.74),P<0.05]，與UUO-7d模型組相比，UUO-14d模型組腎臟巨噬細胞浸潤比例增加[(18.00±2.74)vs(32.00±3.28)，P<0.05；圖2A]。

流式細胞術(shù)(巨噬細胞標志物F4/80)分析表明，假手術(shù)組、UUO 3d、7d、14d小鼠腎組織中巨噬細胞比例分別為(20.8±2.7)%，(31.1±1.3)%，(49.5±2.1)%，(69.6±1.8)%，隨著UUO時間延長，腎組織中巨噬細胞顯著增加(P<0.05；圖2B)。

2.3 各組小鼠腎臟巨噬細胞亞群比例變化

流式細胞術(shù)檢測腎組織中巨噬細胞的活化狀態(tài)，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，UUO-3d模型組小鼠腎間質(zhì)中M2型巨噬細胞(F4/80+CD206+)顯著增加[(3.2±1.9)%vs(34.1±2.1)%,P<0.001]，UUO-7d模型組小鼠腎間質(zhì)中M2型巨噬細胞較UUO-3d模型組增加[(34.1±2.1)%vs(52.6±1.6)%,P<0.001]，與UUO-7d模型組相比，UUO-14d模型組小鼠腎間質(zhì)中M2型巨噬細胞增加[(52.6±1.8)%vs(76.7±2.3)%，P<0.001](圖3A)。各組間M1型巨噬細胞(F4/80+CD86+)[(76.4±3.6)%，(81.8±2.8)%，(80.6±4.4)%，(85.5±2.6)%]變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B)。

圖1 各組小鼠腎纖維化情況

圖2 各組小鼠腎臟巨噬細胞浸潤情況

圖3 各組小鼠腎臟巨噬細胞亞群比例

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在腎纖維化過程中具有保護作用[10]。近年來研究表明，不同亞型巨噬細胞在腎纖維化中的作用存在爭議[11]。本文擬對巨噬細胞在慢性腎臟病中的作用進行研究，并進一步探討巨噬細胞亞型對腎纖維化的影響。

單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型鼠是CKD病理過程研究較理想的模型[12]。在該研究中，我們分別收取假手術(shù)組和模型組3 d，7 d及14 d的小鼠腎臟組織，通過觀察發(fā)現(xiàn)隨著UUO時間延長，小鼠腎間質(zhì)膠原蛋白沉積增多，炎性細胞浸潤增加，免疫熒光及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果進一步證實腎間質(zhì)中巨噬細胞浸潤增多。

巨噬細胞因其高度異質(zhì)性、強可塑性及免疫功能多樣性，在損傷后腎臟中可根據(jù)不同微環(huán)境極化為M1和M2兩種亞型，M1型巨噬細胞特異性表達CD86分子，主要通過分泌腫瘤壞死因子α (tumor necrosises factor-α，TNF-α)、白細胞介素-2和白細胞介素-6等促炎因子促進炎癥反應(yīng)，殺傷機體病原體；M2型巨噬細胞特異性表達CD206分子，主要分泌轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)、炎癥區(qū)分子1(found in inflammatory zone 1，F(xiàn)IZZ1)和精氨酸酶1 (arginase-1，Arg1)等抑炎因子抑制炎癥反應(yīng)，促進組織重構(gòu)和纖維化過程[13,14]。最近研究表明各亞型巨噬細胞均參與腎纖維化形成[15]。為進一步探索巨噬細胞亞型在腎纖維化進程中的作用，我們構(gòu)建不同時間段的UUO模型鼠，分別檢測M1(CD86)和M2(CD206)型巨噬細胞的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組及模型組3，7和14 d的腎組織中M1型巨噬細胞沒有明顯差異，而隨著UUO時間的延長，M2型巨噬細胞所占比例逐漸增大，該結(jié)果提示主要是M2型巨噬細胞而非M1型巨噬細胞極化參與腎纖維化進程。據(jù)文獻報道，其促纖維化機制可能與M2型巨噬細胞分泌TGF-β相關(guān)[16]，但在腎纖維進程中是否與M2型巨噬細胞分泌TGF-β相關(guān)還需進一步證實。

另有研究提示IRAK、SMAD3、Wnt/β-catenin、AMPK-PPARγ等信號通路可能參與巨噬細胞選擇性激活，促進纖維化[8,17]，但腎纖維化進程中的具體分子機制還需進一步探究，為巨噬細胞靶向治療腎纖維化提供思路。