活血散結(jié)方藥物血漿對PDGF干預(yù)下兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖相關(guān)因子及ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路的影響

劉曉清 彭俊 張又瑋 譚涵宇 李建超 吳權(quán)龍 彭清華

摘要：目的? 觀察活血散結(jié)方對血小板源性生長因子（PDGF）干預(yù)下兔視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞增殖的影響，探討其分子機制。方法? 以RPE細胞為研究對象，體外進行RPE細胞原代培養(yǎng)及傳代，建立PDGF干預(yù)下兔RPE細胞增殖模型，并選取PDGF最佳干預(yù)濃度。制備活血散結(jié)方藥物血漿，對兔RPE細胞增殖與毒性的影響進行測定，選取最佳的實驗濃度。實驗分為空白對照組（DMEM）、正常血漿組、PDGF（10 μg/L）組、PDGF（10 μg/L）+AG1296（10 μmol/L）組、PDGF（10 μg/L）+10%藥物血漿組、PDGF（10 μg/L）+20%藥物血漿組。分別加入相應(yīng)處理因素干預(yù)48 h，Transwell流式細胞儀檢測細胞周期變化;Western blot檢測兔RPE細胞cyclin D1蛋白、pERK1/2及ERK1/2蛋白表達。結(jié)果? 10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿對RPE細胞周期、cyclin D1蛋白及pERK1/2、ERK1/2蛋白有抑制作用，與AG1296抑制劑作用相當（P>0.05），與其他組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)論? 活血散結(jié)方藥物血漿可能通過影響ERK信號通路及對周期蛋白的調(diào)控，抑制PDGF干預(yù)下兔RPE細胞增殖。

關(guān)鍵詞：活血散結(jié)方;藥物血漿;視網(wǎng)膜色素上皮細胞;細胞周期;血小板源性生長因子;cyclin D1蛋白;pERK1/2蛋白;ERK1/2蛋白

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0062-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.014

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To investigate the effect of plasma containing invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine on proliferation of rabbit RPE cells treated with PDGF; To discuss the molecular mechanism. Methods The RPE cells were used as the research object and the primitive culture and subculture of RPE cells were proceeded. Rabbit model of RPE cell proliferation treated with PDGF was established， and the best PDGF intervention concentration was chosen. Plasma containing invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine was prepared. The effects of rabbit RPE cell proliferation and toxicity were determined， and the best experimental concentration was selected. The experiment was divided into blank control group （DMEM）， normal plasma group， PDGF （10 μg/L） group， PDGF （10 μg/L） + AG1296 （10 μmol/L） group， PDGF （10 μg/L） + 10% drugplasma group， and PDGF （10 μg/L） + 20% drug plasma group， and corresponding factors were added into each group for intervening for 48 hours. Transwell flow cytometry was used to detect cell cycle changes in different groups. Western blot was used to detect cyclin D1 protein， pERK1/2 and ERK1/2 protein expressions in rabbit RPE cells. Results 10% and 20% concentration of plasma containing invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine inhibited RPE cell cycle， cyclin D1 protein， pERK1/2 and ERK1/2 proteins， which were equivalent to AG1296 inhibitor （P>0.05）. There was statistical significance compared with other groups （P<0.01）. Conclusion Plasma containing invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine may inhibit proliferation of rabbit RPE cells treated with PDGF by affecting ERK signaling pathway and regulation of cyclin.

Keywords： invigorating blood and dissipating masses Chinese medicine; drug plasma; retinal pigment epithelium cells; cell cycle; platelet-derived growth factor; cyclineD1; pERK1/2; ERK1/2

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是1983年由美國視網(wǎng)膜專家協(xié)會提出用于描述孔源性視網(wǎng)膜脫離（rhegmatogenous retinal detachment，RRD）等疾病后玻璃體和或視網(wǎng)膜前后面特異細胞增殖形成可以收縮的細胞性膜，進而引起視網(wǎng)膜牽拉、脫離與固定的一種病變，是一種常見的難治性致盲性眼病^[1]。目前研究表明，PVR是以細胞介導為主的病理過程^[2-3]。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞作為最關(guān)鍵細胞，貫穿于PVR發(fā)生的所有過程。而血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）則是參與PVR形成的主要細胞因子。目前臨床上PVR西藥治療作用比較單一，且細胞毒性大，基因治療技術(shù)目前尚未成熟，手術(shù)治療存在難度、風險大且易復(fù)發(fā)。中醫(yī)辨證論治，不良反應(yīng)較小，能取得良好的療效^[4]?；钛⒔Y(jié)方根據(jù)眼科水血同治的原則組成^[5]，本實驗觀察其藥物血漿對PDGF-BB干預(yù)下兔RPE細胞的細胞周期、cycling D1蛋白、pERK1/2及ERK1/2蛋白表達的影響，探討該方有效治療PVR與細胞增殖相關(guān)的作用機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

成年健康無眼疾青紫藍兔8只，雌雄不限，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，上海市松江區(qū)車墩實驗動物良種場提供，動物許可證號SXCK（滬）2012-0008。成年健康家兔10只，雌雄不限，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK（湘）2015-0004。飼養(yǎng)于室溫18～26 ℃、相對濕度約55%環(huán)境，保持空氣流通，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。實驗前行常規(guī)眼科檢查（裂隙燈、間接眼底鏡），排除眼內(nèi)外疾患后進入實驗。實驗前所有動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2? 藥物及制備

活血散結(jié)方（三七6 g、丹參15 g、昆布15 g等），飲片由湖南中醫(yī)藥大第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，水煎2次，將藥液混合濃縮至含1.025 g原藥材/mL，4 ℃保存。

1.3? 主要試劑與儀器

DMEM/F12（美國Hyclone），胎牛血清（杭州四季青），流式細胞周期檢測試劑盒（南京凱基），PDGF-BB（美國Sigma），AG1296（美國Selleck），RIPA組織細胞快速裂解液（碧云天），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天），30%丙烯酰胺（Solarbio），Tris（Solarbio），HCl（國藥集團），SDS（美國Sigma），過硫酸銨（Solarbio），TEMED（國藥集團），5X SDS-PAGE loading buffer（Vazyme），蛋白預(yù)染Marker（Fermentas），PVDF膜（Millipore），脫脂奶粉（Solarbio），PBS（博士德），Tween-20（Amresco），ECL發(fā)光液（美國Thermo），PDGF-BB（美國Sigma），HRP羊抗鼠二抗（Proteintech），cyclin D1小鼠單克隆抗體（Abcam），GAPDH小鼠單克隆抗體（Proteintech），ERK1/2小鼠單克隆抗體（Abcam），pERK1/2小鼠單克隆抗體（Abcam），GAPDH小鼠單克隆抗體（Proteintech），HRP羊抗鼠二抗（Proteintech）。CO₂細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）、生物安全柜（美國Thermo），倒置顯微鏡（德國Motic），低速離心機（美國Thermo），MDF-382E型超低溫冰箱（日本Sanyo），壓力蒸汽滅菌器（上海亞明熱處理設(shè)備公司），熒光顯微鏡（德國Zeiss），低速離心機（美國Thermo），MDF-382E型超低溫冰箱（日本Sanyo），單通道移液器（德國Eppendorf），八通道電動移液器（德國Eppendorf），酶標儀（美國Bio-tek，ELX800）。

2? 實驗方法

2.1? 藥物血漿制備

成年健康家兔10只，隨機分為空白組和活血散結(jié)方組。根據(jù)人與家兔體表面積換算方法計算（人以60 kg體質(zhì)量為標準，家兔以1.6 kg體質(zhì)量為標準）活血散結(jié)方家兔臨床等效劑量為5.064 g/（kg·d）。取4倍家兔臨床等效劑量為每日20.256 g/kg≈20.5 g/kg，水煎制成濃度為1.025 g原藥材/mL活血散結(jié)方藥液?；钛⒔Y(jié)方組每日20 mL/kg灌胃2次，空白組灌服等量蒸餾水，連續(xù)5 d。第5日灌胃2 h后麻醉腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min，收集上清液即為藥物血漿。0.22 μm過濾器分裝，置于-70 ℃冰箱保存。

2.2? 原代兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞的培養(yǎng)及鑒定

利用青紫藍兔為實驗對象，按酶消化法獲取RPE細胞原代細胞。5 mL注射器于青紫藍兔耳緣靜脈處空氣栓塞法處死，無菌條件下取出眼球，去除表面筋膜，生理鹽水洗凈，浸泡于4 ℃、400 U/mL慶大霉素生理鹽水。PBS沖洗3次后去除角膜、晶狀體以及玻璃體。D-Hanks液中漂洗2次，滴加0.25%胰酶，室溫下靜置10 min，由視網(wǎng)膜周邊至視乳頭方向輕輕去除視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層后PBS沖洗3次。滴加0.25%胰蛋白酶0.2 mL，置于細菌培養(yǎng)箱中消化30 min，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。獲取細胞懸液，800 r/min離心10 min，棄上清液。在離心管再次胰酶消化、吹打，加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，離心，棄去上清液，加入10%胎牛培養(yǎng)基將細胞吹打分散，將RPE細胞調(diào)整為（4～5）×10⁴個/mL的密度，并接種于25 mL培養(yǎng)瓶，在含5%CO₂、濕度為90%的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后每3 d更換培養(yǎng)液，直到細胞融合。當細胞貼壁鋪滿大部分瓶底即可進行傳代培養(yǎng)。取原代生長RPE細胞，PBS洗滌2次，胰酶消化，細胞脫壁分散后即加少量完全培養(yǎng)基終止消化。1000 r/min離心4 min，棄上清液，加1～2 mL完全培養(yǎng)液后吹勻，按（4～5）×10⁴個/mL的細胞密度傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期第2代細胞，用Cytokeratin-8特異性抗體免疫熒光法^[6]在熒光顯微鏡下進行觀察鑒定。

2.3? 活血散結(jié)方藥物血漿干預(yù)視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖測定

選取第4代體外培養(yǎng)兔RPE細胞，分為空白對照組（DMEM），正常血漿組（正常血漿）及5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%藥物血漿組（取血漿樣本，按體積比1∶2加入純甲醇，渦旋混合10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，40 ℃氮氣吹干，成凍干粉。用培養(yǎng)基溶分別溶解成7個濃度藥物血漿。96孔板培養(yǎng)板培養(yǎng)，每組各設(shè)5個復(fù)孔。采用CCK-8法檢測兔RPE細胞活力。取對數(shù)生長期兔RPE細胞，用培養(yǎng)基配成細胞懸液并調(diào)整細胞密度至50個/μL，每孔（96孔板培養(yǎng)板）加入100 μL，鋪板后用PBS填充邊緣孔。置于培養(yǎng)箱，5%CO₂、37 ℃孵育，待細胞單層鋪滿孔底，加入用無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度的藥物血漿，每孔總體積為200 μL。培養(yǎng)48 h后，每孔加10 μL 7sea-cell counting kit。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，應(yīng)用酶標儀檢測450 nm處的吸光度（OD）。記錄結(jié)果，繪制圖表，計算各組細胞增殖抑制率和IC₅₀。細胞增殖抑制率（%）=[1-（實驗組OD值÷正常血漿組OD值）]×100%。

2.4? 血小板源性生長因子干預(yù)視網(wǎng)膜色素上皮細胞細胞增殖測定

選取第4代體外培養(yǎng)兔RPE細胞，實驗分為空白對照組（DMEM）和PDGF低（5 μg/L PDGF-BB）、中（10 μg/L PDGF-BB）、高（20 μg/L PDGF-BB）劑量組。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，96孔板加100 μL/孔，鋪板，使待測細胞密度至5000個細胞/孔，邊緣孔用PBS填充。設(shè)5個復(fù)孔/樣本/濃度，5%CO₂、37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入用無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度梯度的藥物，5%CO₂、37 ℃培養(yǎng)48 h。每孔加10 μL試劑盒中7sea-cell counting kit溶液，同步設(shè)調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶標儀450 nm處測定OD。

2.5? 活血散結(jié)方藥物血漿和血小板源性生長因子干預(yù)兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖測定

實驗細胞選取第4代體外培養(yǎng)兔RPE細胞，分為空白對照組（DMEM）、正常血漿組（正常血漿）、PDGF組（10 μg/L PDGF-BB）、PDGF+AG1296組（10 μg/L PDGF-BB+10 μmol/L AG1296）、PDGF+10%藥物血漿組（10 μg/L PDGF-BB+10%活血散結(jié)藥物血漿）、PDGF+20%藥物血漿組（10 μg/L PDGF-BB 20%活血散結(jié)藥物血漿）。

2.6? 流式細胞儀檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞周期

胰酶消化并收集對數(shù)生長期的RPE細胞，調(diào)整細胞懸液密度至5×10⁵個/mL，取6孔板，根據(jù)“2.5”項下分組情況每個孔板加入相應(yīng)細胞1 mL/孔上述細胞懸液，補足2 mL完全培養(yǎng)基，輕輕混勻，置于5%CO₂、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至每孔內(nèi)細胞融合率達70%～80%，根據(jù)分組加入相應(yīng)干預(yù)因素，48 h后收樣，流式細胞儀檢測細胞周期。步驟：離心收集細胞，棄上清，用預(yù)冷PBS沖洗細胞2次;加入預(yù)冷70%乙醇，于4 ℃固定過夜;離心收集細胞，1 mL PBS沖洗細胞1次，加450 μL PBS重懸細胞，加50 μL RnaseA（2.5 mg/mL），使RNase A 終濃度為250 μg/mL，4 ℃避光孵育30 min;取50 μL碘化丙錠（1 mg/mL），加入上述細胞懸液中，使PI終濃度為100 μg/mL，4 ℃避光孵育30 min。1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

2.7? Western blot檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞cyclin D1、pERK1/2及ERK1/2蛋白表達

用胰酶消化液消化并收集對數(shù)生長期的RPE細胞;調(diào)整細胞懸液密度至5×10⁵個/mL;取6孔板，根據(jù)“2.5”項下分組情況加入相應(yīng)細胞1 mL/孔上述細胞懸液，補足2 mL完全培養(yǎng)基，輕輕混勻;置于5%CO₂、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng);至每孔內(nèi)細胞融合率達70%～80%，根據(jù)分組加入相應(yīng)干預(yù)因素;48 h后收樣，進行Western blot檢測。將需要抽提的蛋白細胞樣本加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃充分裂解，將其刮入1.5 mL EP管中，95 ℃以上加熱10 min，12 000×g離心10 min，取上清液，進行蛋白質(zhì)定量后置于-80 ℃冰箱保存。取等量蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。根據(jù)說明書稀釋一抗，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2 h或4 ℃孵育過夜。孵育一抗膜用TBST洗滌3次×5 min，隨后根據(jù)用量，按1∶2000稀釋HRP標記的二抗，與膜37 ℃孵育1 h。用TBST洗滌3次×5 min。最后用ECL化學發(fā)光檢測，將膠片進行掃描，用圖像分析軟件IPP6.0對圖像進行灰度分析。

3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，組間兩兩比較用LSD法（方差齊）或Tamhane法（方差不齊）。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4? 結(jié)果

4.1? 兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞生長狀況及鑒定

倒置顯微鏡下觀察，采用酶消化法取材，RPE原代細胞呈圓形，胞體透亮，胞漿內(nèi)可見較多黑色素顆粒，可見清晰透明的單核細胞或雙核細胞。接種24 h后，細胞開始貼壁伸出偽足，逐漸變成扁平不規(guī)則多角形，分裂繁殖增快，生長活躍。5～7 d細胞基本融合呈鑲嵌狀排列。傳代細胞1 h開始貼壁，24 h大部分貼壁伸出偽足，胞漿內(nèi)黑色素顏色和顆粒隨著傳代次數(shù)的增加而減少，傳至第4代時明顯減少。傳至第6代時，胞體透亮肥大，胞漿內(nèi)色素完全消失，細胞輪廓清楚，細胞核及核仁清晰可見。Cytokeratin-8特異性抗體免疫熒光法結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下觀察RPE細胞，熒光遍及胞質(zhì)，細胞角蛋白染色呈強陽性。

4.2? 活血散結(jié)方藥物血漿對兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖和毒性的影響

活血散結(jié)方藥物血漿各組干預(yù)RPE細胞48 h后細胞增殖與毒性檢測結(jié)果顯示，藥物血漿對RPE細胞均有不同程度的增殖抑制作用，且存在一定量效關(guān)系（正相關(guān)），其中5%～20%活血散結(jié)方藥物血漿對細胞有較弱的抑制作用，與正常血漿組比較，細胞活力OD值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而4%～100%活血散結(jié)方藥物血漿對細胞的抑制作用則更為明顯，與正常血漿組比較，細胞活力OD值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;20%以下藥物血漿對RPE細胞的增殖抑制率低于1.92%，計算活血散結(jié)方藥物血漿IC₅₀為95.65%，表明此次制備的活血散結(jié)方藥物血漿雖然對RPE細胞有一定的增殖抑制作用，但毒性較低，20%及以下濃度活血散結(jié)方藥物血漿對RPE細胞無明顯細胞毒性。綜合以上結(jié)果考慮選取10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿作為下一步實驗干預(yù)濃度。結(jié)果見表1。

4.3? 血小板源性生長因子對兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖的影響

不同劑量PDGF對RPE細胞的細胞活力均有一定的增強作用，且存在一定的量效關(guān)系，與空白對照組比較，細胞活力OD值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;其中PDGF中、高劑量組較PDGF低劑量組作用更強，細胞活力OD值差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而PDGF中劑量組與PDGF高劑量組作用相當，細胞活力OD值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。故選取10 μg/L PDGF-BB作為下一步實驗干預(yù)濃度。結(jié)果見表2。

4.4? 活血散結(jié)方藥物血漿對血小板源性生長因子干預(yù)下視網(wǎng)膜色素上皮細胞周期的影響

PDGF對RPE細胞周期有明顯影響作用，PDGF組S+G2期比例高于正常血漿組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明PDGF有促進RPE細胞增殖的作用;AG1296對RPE細胞周期有明顯影響作用，PDGF+AG1296組S+G2期比例低于PDGF組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明AG1296具有抑制RPE細胞增殖的作用，能阻止PDGF促RPE細胞增殖;而10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿亦能明顯影響RPE細胞周期，2個濃度活血散結(jié)藥物血漿組S+G2期比例均低于PDGF組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明2個濃度活血散結(jié)方藥物血漿均有抑制RPE細胞增殖的作用，能阻止PDGF促RPE細胞增殖，均與AG1296抑制劑作用相當，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿作用相當，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

4.5? 活血散結(jié)方藥物血漿對視網(wǎng)膜色素上皮細胞cyclin D1蛋白表達的影響

PDGF有促進RPE細胞cyclin D1蛋白表達的作用，與正常血漿組比較，PDGF組RPE細胞cyclin D1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;AG1296有抑制RPE細胞cyclin D1蛋白表達的作用，PDGF+AG1296組RPE細胞cyclin D1蛋白表達低于PDGF組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明AG1296具有阻止PDGF促RPE細胞cyclin D1蛋白表達的作用;而10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿均可抑制RPE細胞cyclin D1蛋白表達，2個濃度活血散結(jié)方藥物血漿組RPE細胞cyclin D1蛋白表達均低于PDGF組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明2個濃度活血散結(jié)方藥物血漿均具有阻止PDGF促RPE細胞cyclin D1蛋白表達的作用，與AG1296抑制劑作用均相當，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且2個濃度活血散結(jié)方藥物血漿組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表4。

4.6? 活血散結(jié)方藥物血漿對視網(wǎng)膜色素上皮細胞ERK信號通路蛋白表達的影響

PDGF有促進RPE細胞pERK1/2、ERK1/2蛋白表達的作用，與正常血漿組比較，PDGF組RPE細胞pERK1/2、ERK1/2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;AG1296有抑制RPE細胞pERK1/2、ERK1/2蛋白表達的作用，PDGF+AG1296組RPE細胞pERK1/2、ERK1/2蛋白表達低于PDGF組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明AG1296具有阻止PDGF促RPE細胞pERK1/2、ERK1/2蛋白表達的作用;而10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿均可抑制RPE細胞pERK1/2、ERK1/2蛋白表達，2個濃度藥物血漿組RPE細胞pERK1/2、ERK1/2蛋白表達均低于PDGF組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明2個濃度活血散結(jié)方藥物血漿具有阻止PDGF促RPE細胞pERK1/2、ERK1/2蛋白表達的作用，但與AG1296抑制劑作用相當，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且2個濃度活血散結(jié)方藥物血漿組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表5。

5? 討論

中醫(yī)對視網(wǎng)膜增殖物的辨證，認為凡出血所致日久不散變成膜狀物多屬氣血瘀滯，炎癥所致的增殖多因痰濕凝結(jié)?；钛⒔Y(jié)方中三七化瘀止血活血，丹參活血祛瘀，入肝經(jīng)血分，二藥合用活血化瘀，共為君藥;昆布消痰軟堅、利水消腫，入肝腎兩經(jīng)。全方共奏活血化瘀、軟堅散結(jié)之功，使眼內(nèi)瘀血痰結(jié)之有形之物消散，改善眼底情況，提高患者視功能。陳吉等^[7-8]研究表明，活血利水法能降低PVR增殖膜中轉(zhuǎn)化生長因子-β1、纖維連接蛋白信使核糖核酸陽性表達，抑制PVR的發(fā)生發(fā)展。付美林等^[9-10]研究也顯示，活血利水法可通過拮抗增殖膜中整合素β1、EGF mRNA表達的作用來抑制增殖細胞的過度增生，從而防治PVR形成和發(fā)展。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是真核細胞內(nèi)普遍存在的參與調(diào)節(jié)細胞生物學反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，與細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等不同調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)。Ras/Raf/MEK/ERK是其中重要的信號通路，而ERKl/2是這一信號通路下游的核心元件。Punn等^[11]發(fā)現(xiàn)ERKl/2信號傳導通路的激活可促進各種細胞增殖分裂、分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子合成，對細胞損傷修復(fù)意義重大。但病理情況下，由細胞外刺激調(diào)節(jié)的RPE細胞ERKl/2信號傳導通路激活并擴大，則有RPE細胞增殖、分化過度的可能，導致視網(wǎng)膜前或視網(wǎng)膜下的RPE細胞過量增殖，分化轉(zhuǎn)型，終至PVR增殖膜的形成。PDGF可通過與RPE細胞細胞膜上的PDGF受體結(jié)合，激活相應(yīng)絡(luò)氨酸蛋白激酶通路，引發(fā)RPE細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)放大反應(yīng)，促進RPE增殖、遷移及凋亡。司艷芳等^[12]通過體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB誘導的人RPE細胞的生物學活動主要通過ERKl/2、p38和PI3K等細胞信號轉(zhuǎn)導通路完成，ERKl/2主要與人RPE細胞的增殖相關(guān)，而p38和PI3K主要與RPE細胞的遷移相關(guān)。

Motkura等^[13]于1991年發(fā)現(xiàn)了cyclin D1基因，其編碼翻譯后的cyclin D1蛋白對細胞周期起著正性調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1在細胞生長周期G1期向S期轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要作用^[14]。有研究表明， cyclin D1表達過度可導致細胞分裂增殖明顯提高，甚至有惡變可能^[15]。已有多項研究證實，cyclin D1的表達減少會阻滯細胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)化^[16-20]。郭麗莉等^[21]通過細胞實驗也發(fā)現(xiàn)，RPE細胞中cyclin D1的表達減少同樣會阻滯細胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)化。

本實驗研究結(jié)果顯示，10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿均能降低PDGF干預(yù)下兔RPE細胞S+G2期的比例，且存在一定的量效關(guān)系趨勢，與PDGF組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿均有抑制PDGF干預(yù)下兔RPE細胞的增殖、遷移的作用，抑制PDGF干預(yù)下兔RPE細胞進入分裂增殖周期。2個濃度藥物血漿以上作用均與AG1296相當（P>0.05），但10%和20%活血散結(jié)方藥物血漿以上作用亦相當（P>0.05）。研究結(jié)果還顯示，10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿均能抑制PDGF干預(yù)下兔RPE細胞與細胞增殖相關(guān)的細胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1及ERK1/2細胞信號通路pERK1/2、ERK1/2蛋白的表達，且存在一定的量效關(guān)系趨勢，與PDGF組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），均與AG1296作用相當（P>0.05），10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿以上作用亦相當（P>0.05）。表明10%、20%活血散結(jié)方藥物血漿均能通過抑制cyclin D1蛋白的表達及抑制ERK1/2細胞信號通路pERK1/2、ERK1/2蛋白的表達而阻止RPE細胞分裂增殖。

綜上，活血散結(jié)方藥物血漿能有效抑制RPE細胞增殖，其機制是通過抑制ERK信號通路，以及對周期蛋白的調(diào)控來抑制RPE細胞增生。

參考文獻：

[1] 任彥新.姜黃素在增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變中對表皮生長因子的作用[D].石家莊：河北醫(yī)科大學，2016.

[2] 苗景鵬，魏文斌.增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制及治療研究進展[J].國際眼科縱覽，2013，37（6）：367-373.

[3] 韓瑞芳.增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變相關(guān)細胞因子研究進展[J].中華實驗眼科雜志，2016，34（8）：765-768.

[4] 楊曉旭，楊冬萍，俞洋.中醫(yī)藥防治增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2017，19（12）：109-112.

[5] 彭俊，曾志成，譚涵宇，等.眼科活血利水法的基礎(chǔ)研究進展[J].眼科新進展，2010，30（6）：585-589，593.

[6] 胡健艷，陳雪，陳輝，等.兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)和鑒定[J].南通大學學報，2005，25（3）：171-173.

[7] 陳吉，彭清華，邢雁飛，等.活血利水法對外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變兔眼玻璃體TGF-β1表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2010， 30（5）：12-15.

[8] 陳吉，彭清華，邢雁飛，等.活血利水法對外傷性PVR兔眼玻璃體FN mRNA表達的影響[J].國際眼科雜志，2009，9（12）：2303-2306.

[9] 付美林，彭清華，陳吉，等.活血利水法對兔外傷性PVR增殖膜上EGF mRNA表達的影響[J].國際眼科雜志，2012，12（1）：25-29.

[10] 付美林，彭清華，陳吉，等.活血利水法對兔外傷性玻璃體視網(wǎng)膜病變增殖膜上整合素β1表達的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（4）：722-725.

[11] PUNN A， MOCRIDGE J W， FAROOQUI S， et al. Sustained activation of p42/p44 mitogen-activated protein kinase during recovery from simulated ischaemia mediates adaptive cytoprotection in cardiomyocytes[J]. Biochem J，2000，350：891-899.

[12] 司艷芳，王君，關(guān)娟，等.血小板來源的生長因子通過ERK/p38/PI3K促進人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的增殖、遷移[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012：12（34）：6628-6631.

[13] MOTKURA T， BLOOM T， KIM H G， et al. A novel cyclinencoded by a bell-linked candidate oncogene[J]. Nature，1991，350：512.

[14] MARX J. How cells cycle toward cancer[J]. Science，1994，263：319- 321.

[15] SHERR C J. G1 phase progression：cycling on cue[J]. Cell，1994， 79：551-555.

[16] GAO J， ZHU J， LI H Y， et a1. Small interfering RNA targeting integrin linked kinase inhibited the growth and induced apoptosis inhuman bladder cancer cells[J]. Int J Biochem Cell Biol，2011， 43：1294-1304.

[17] PERSAD S， ATTWELL S， GRAY V， et a1. Inhibition of integrin- linked kinase （ILK） suppresses activation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：3207- 3212.

[18] ZHU X Y， LIU N， LIU W， et a1. Silencing of the integrin-linked kinase gene suppresses the proliferation，migration and invasion of pancreatic cancer cells （Panc.1）[J]. Genet Mol Biol，2012，35：538- 544.

[19] D'AMICO M，HULIT J， AMANATULLAH D F， et a1. The integrin-linked kinase regulates the cyclin D1 gene through glycogen synthase kinase 3beta and cAMP-responsive element-binding protein dependent pathways[J]. J Biol Chem，2000，275：32649-32657.

[20] WANG D L， LAN J H， CHEN L， et al. Integrin-linked kinase functions as a tumor promoter in bladder transitional cell carcinoma[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2012，13：2799-2806.

[21] 郭麗莉，于文貞，黎曉新，等.整合素連接激酶對視網(wǎng)膜色素上皮細胞生長、凋亡和分泌功能的影響[J].中華實驗眼科雜志，2013，31（8）：729- 733.