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    高鈣離子誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞自噬對(duì)炎癥因子生成的影響*

    2019-03-26 02:26:22易凱趙嘉聞黎承楊程繼文趙雨桐馬晨俊廖乃凱鄧耀良
    廣東醫(yī)學(xué) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:腎小管腎結(jié)石培養(yǎng)液

    易凱, 趙嘉聞, 黎承楊, 程繼文, 趙雨桐, 馬晨俊, 廖乃凱, 鄧耀良

    廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科(廣西南寧 530021)

    高鈣尿癥是草酸鈣腎結(jié)石形成和復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素[1]。研究發(fā)現(xiàn),高濃度的鈣離子可刺激腎小管上皮細(xì)胞損傷,細(xì)胞大量表達(dá)炎性因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。上皮細(xì)胞損傷后繼發(fā)出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是參與結(jié)石形成的重要過(guò)程,是當(dāng)前結(jié)石基礎(chǔ)研究的關(guān)注點(diǎn)之一[2]。我們前期的體內(nèi)及體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),含鈣腎結(jié)石患者尿液炎性細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1) 和高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1) 生成增多,高鈣離子可刺激腎小管上皮細(xì)胞大量表達(dá)這兩種細(xì)胞因子[3]。因此我們?cè)O(shè)想,MCP-1和HMGB1在草酸鈣腎結(jié)石的形成過(guò)程中可能起重要作用,抑制這兩種細(xì)胞因子的生成可能對(duì)預(yù)防高鈣尿癥導(dǎo)致的草酸鈣腎結(jié)石的形成有效。細(xì)胞自噬是一種以溶酶體途徑的生物降解過(guò)程,對(duì)細(xì)胞生存、分化、發(fā)育和體內(nèi)平衡至關(guān)重要,并且細(xì)胞自噬參與人類(lèi)許多疾病的發(fā)病機(jī)制,如癌癥、某些神經(jīng)退行性疾病、肌病和傳染病[4-5]。最近一些研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞自噬與腎臟疾病有關(guān)[6]。目前,尚缺乏有關(guān)細(xì)胞自噬與炎癥和腎結(jié)石疾病是否存在關(guān)聯(lián)的文獻(xiàn)報(bào)道。2017年4—12月,我們進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),觀察高鈣離子誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)發(fā)生細(xì)胞自噬對(duì)細(xì)胞炎癥因子生成的影響。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料 HK-2 (中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心); 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR 相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa; 人MCP-1、HMGB1 和GAPDH 引物上海生工合成;Western blot所用二抗從購(gòu)自Sigma;β-actin鼠一抗購(gòu)自Abcam; LC3B兔一抗購(gòu)自CST; beclin 1 兔一抗購(gòu)自CST; MTT購(gòu)自凱杰;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibco;氯喹(CQ)、3-MA購(gòu)自Sigma。

    1.2 正常培養(yǎng)液和鈣離子培養(yǎng)液的配制 正常培養(yǎng)液為DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素混合液。鈣離子培養(yǎng)液使用6.66 g 二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)配制成含0.3 mol/L Ca2+的母液,經(jīng)過(guò)高壓滅菌冷卻后,用DMEM稀釋成含5 mmol/L、10 mmol/L Ca2+的兩個(gè)濃度梯度高鈣離子培養(yǎng)液。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法 體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,分別用正常培養(yǎng)液(不含Ca2+溶液),5 mmol/L Ca2+溶液,10 mmol/ L Ca2+溶液進(jìn)行處理12 h,以及用10 mmol/L Ca2+液各處理0、6、12 h。之后采用Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值)和自噬相關(guān)因子Beclin1的表達(dá)水平,實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)方法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子HMGB1及MCP-1的表達(dá)水平。同時(shí),利用不同濃度的細(xì)胞自噬抑制劑3-甲基腺苷(0、5、10、15 mmol/L 3-MA)和氯喹(0、10、20、30 μmol/L CQ)分別預(yù)處理HK-2細(xì)胞6 h,隨后再用上述3個(gè)濃度梯度的Ca2+溶液處理HK-2細(xì)胞12 h,采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞自噬對(duì)炎癥因子HMGB1及MCP-1表達(dá)的影響。另外,HK-2細(xì)胞分別用4個(gè)濃度梯度(0、10、20、30 μmol/L)CQ預(yù)處理6 h,再用10 mmol/L Ca2+培養(yǎng)液處理12 h,MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞抑制率。

    1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 處理的細(xì)胞直接在6 孔培養(yǎng)板中加入TRIzol 裂解細(xì)胞,按總RNA 提取試劑盒操作說(shuō)明步驟提取總RNA,紫外分光光度儀測(cè)定RNA的濃度。取500 ng RNA用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄體系獲得cDNA。實(shí)時(shí)定量RT-PCR采用SYBR ExScript RT-PCR Kit試劑盒對(duì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行定量,看家基因GAPDH表達(dá)作為內(nèi)參。反應(yīng)步驟:95℃ 30 s;95℃ 15 s;60℃ 1 min;40個(gè)循環(huán)。MCP-1 的上游引物為5′-AGCAGCAAGTGTCCCAAAGA-3′,下游引物為5′-GGTGGTCCATGGAATCCTGA-3′;HMGB1 的上游引物為5′-GATCCCAATGCACCCAAGAG-3′,下游引物為5′-TCGCAACATCACCAATGGAC-3′;GAPDH 的上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

    1.5 蛋白印跡檢測(cè)(Western blot) 處理的HK-2細(xì)胞用無(wú)菌的PBS洗滌3次,RIPA細(xì)胞裂解液(含1%蛋白酶抑制劑(PMSF)(博士德)裂解細(xì)胞。裂解的細(xì)胞液蛋白濃度用BCA(bicinchoninic acid)法測(cè)定(碧云天)法測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)中Western blot使用的一抗?jié)舛确謩e為:兔抗-LC3B 1∶2 000;兔抗-beclin1:1∶2 000鼠抗-β-actin 1∶2 000,二抗?jié)舛?1∶5 000。Western blot步驟參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

    1.6 MTT 檢測(cè)各組細(xì)胞活力的抑制率 取生長(zhǎng)良好的第5 代HK-2 細(xì)胞,以1×104/孔的密度接種于96 孔板,每個(gè)組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。處理的細(xì)胞每孔加入50 μL 的MTT 溶液,37 ℃孵育4 h 后,棄上清液,每孔加入200 μL DMSO。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)下,測(cè)定吸光度(absorbance,A) 值。根據(jù)公式: 細(xì)胞活力抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值) 計(jì)算抑制率。

    2 結(jié)果

    2.1 高鈣離子誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞自噬 不同濃度Ca2+液處理的HK-2細(xì)胞內(nèi)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白的表達(dá)相對(duì)水平的比值分別為1.00±0.34、2.10±0.10、3.89±0.21(P<0.05);Beclin1的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.06、2.12±0.17、3.28±0.29(P<0.05),見(jiàn)圖1-A。10 mmol/L Ca2+液處理的不同時(shí)間段HK-2細(xì)胞內(nèi)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白的表達(dá)相對(duì)水平的比值分別1.00±0.12、3.06±0.24、4.24±0.28(P<0.05);Beclin1的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.15、2.58±0.30、3.55±0.37(P<0.05),見(jiàn)圖1-B。

    A:不同濃度高鈣離子溶液處理的HK-2細(xì)胞內(nèi)LC3B和Beclin1蛋白表達(dá)水平;B:10 mmol/L高鈣離子溶液處理不同時(shí)間的HK-2細(xì)胞內(nèi)LC3B和Beclin1蛋白表達(dá)水平

    圖1高鈣溶液處理的HK-2細(xì)胞內(nèi)LC3B和Beclin 1蛋白表達(dá)水平

    2.2 高鈣離子刺激HK-2細(xì)胞MCP-1、HMGB1的表達(dá) 與不含Ca2+溶液處理組比較,高鈣離子環(huán)境刺激下,HK-2細(xì)胞MCP-1和HMGB1 mRNA的表達(dá)顯著增多(P<0.05),具有濃度及時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

    項(xiàng)目不同濃度Ca2+液10 mmol/L Ca2+液處理不同時(shí)間0 mmol/L5 mmol/L10 mmol/L0 h6 h12 hMCP-11.00±0.313.27±0.46?4.65±0.23?1.00±0.102.67±0.05△4.29±0.27△HMGB11.00±0.051.34±0.20?1.56±0.16?1.00±0.071.30±0.19△1.67±0.24△

    *與0 mmol/L Ca2+液組比較P<0.05; △與處理0 h組比較P<0.05

    2.3 自噬抑制劑3-MA和CQ對(duì)高鈣離子環(huán)境刺激下HK-2細(xì)胞MCP-1和HMGB1表達(dá)的影響 不含CQ處理組與20 μmol/L CQ處理組細(xì)胞內(nèi)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表達(dá)水平的比值分別為:1.00±0.23、4.34±0.14,P<0.05;不含3-MA處理組與10 mmol/L 3-MA處理組細(xì)胞內(nèi)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值分別為:1.00±0.09、0.45±0.15(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

    與不含Ca2+溶液處理組比較,CQ或3-MA預(yù)處理能顯著下調(diào)高鈣離子誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)MCP-1 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05),CQ或3-MA預(yù)處理對(duì)高鈣離子誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。見(jiàn)表2。

    與不含CQ處理組比較,10、20、30 μmol/L CQ預(yù)處理能顯著下調(diào)高鈣離子處理的細(xì)胞內(nèi)MCP-1 mRNA的表達(dá)(P<0.05),呈濃度依賴(lài)趨勢(shì);CQ預(yù)處理對(duì)HMGB1 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。見(jiàn)表3。

    圖2 CQ和3-MA處理后LC3B-Ⅰ、Ⅱ蛋白的表達(dá)

    Ca2+液CQ(20 μmol/L)3-MA(10 mmol/L)MCP-1HMGB1MCP-1HMGB10 mmol/L1.00±0.121.00±0.141.00±0.091.00±0.095 mmol/L 0.32±0.03?1.26±0.17 0.58±0.12? 0.96±0.1210 mmol/L 0.41±0.15?1.13±0.21 0.60±0.06? 1.16±0.10

    *與0 mmol/L Ca2+液組比較P<0.05

    因子0 μmol/L10 μmol/L20 μmol/L30 μmol/LMCP-11.00±0.110.77±0.15?0.46±0.09?0.30±0.11?HMGB11.00±0.091.09±0.141.13±0.171.04±0.21

    *與0 μmol/L CQ處理組比較P<0.05

    2.4 自噬抑制劑對(duì)高鈣離子環(huán)境下細(xì)胞活性的影響 與不含CQ處理組比較(未預(yù)處理組),不同濃度的CQ預(yù)處理后,10 mmol/L Ca2+離子液處理的細(xì)胞抑制率顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表4。

    CQ未預(yù)處理組預(yù)處理組10 μmol/L52.0±3.4043.0±6.30?20 μmol/L50.0±4.2033.0±7.30?30 μmol/L48.0±3.6024.0±4.12?

    *與未預(yù)處理組比較P<0.05

    3 討論

    腎結(jié)石在形成過(guò)程中,腎小管上皮細(xì)胞會(huì)暴露在高濃度的鈣離子、草酸、草酸鈣和(或)磷酸鈣晶體中。高濃度鈣離子可刺激腎小管上皮細(xì)胞活性氧大量形成,導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[2]。此外,活性氧還能激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)分子信號(hào)通路,包括轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB,炎性因子[如MCP-1、白細(xì)胞介素(IL)-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]生成增多[8]。上皮細(xì)胞損傷后繼發(fā)出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是參與結(jié)石形成的重要過(guò)程,其不僅可以導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥和纖維化,同時(shí)又可以進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[2,9-10]。炎癥因子MCP-1、HMGB1均可趨化單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織[11-12]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高鈣尿癥患者尿液炎性細(xì)胞因子MCP-1、HMGB1生成增多[3,13]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)高濃度鈣離子能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞上調(diào)MCP-1、HMGB1的表達(dá)水平。

    自噬是一種通過(guò)溶酶體途徑降解內(nèi)源性異常及過(guò)剩蛋白、損壞的細(xì)胞和細(xì)胞器的過(guò)程,它在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)包括細(xì)胞饑餓、細(xì)胞氧化應(yīng)激、活性氧、缺氧、蛋白質(zhì)聚集或受損細(xì)胞器等各種應(yīng)激狀態(tài)中起著重要的作用[14]。細(xì)胞自噬基本過(guò)程包括:在細(xì)胞質(zhì)中形成雙層膜結(jié)構(gòu)-自噬體,自噬體吞噬異常、過(guò)剩蛋白,損壞的細(xì)胞和細(xì)胞器;然后自噬體與溶酶體融合,自噬體運(yùn)載的異常、過(guò)剩蛋白、損壞的細(xì)胞和細(xì)胞器在溶酶體中進(jìn)行酶消化。使細(xì)胞有害物質(zhì)不僅從細(xì)胞中清除,而且被溶酶體消化后形成的新物質(zhì)還可用于合成新的蛋白質(zhì)或細(xì)胞[15]。自噬與腎臟疾病有明顯關(guān)聯(lián),例如,自噬基因ATG 5或ATG 7突變能導(dǎo)致小鼠局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥[16];TGF-β通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)腎纖維化[17]。腎缺血再灌注性損傷的發(fā)生能誘導(dǎo)近端腎小管上皮細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞自噬[18]。在本實(shí)驗(yàn)中,體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞在高鈣離子刺激下,LC3B-Ⅱ(細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白)和Beclin1蛋白(細(xì)胞自噬形成中的重要因子)表達(dá)水平顯著上調(diào),并且呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴(lài)性,提示高鈣離子誘導(dǎo)了HK-2細(xì)胞自噬。

    近年來(lái)有關(guān)細(xì)胞自噬與炎癥因子的相互作用被廣泛研究。在腎缺血再灌注性損傷研究中,自噬發(fā)生能抑制細(xì)胞HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)[19]。有研究發(fā)現(xiàn),MCP-1在心力衰竭疾病過(guò)程中不僅能趨化單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織,還能通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞自噬而促進(jìn)心力衰竭[20]。在本實(shí)驗(yàn)中,使用自噬抑制劑CQ或3-MA能有效地抑制高鈣離子刺激HK-2 細(xì)胞MCP-1的表達(dá)水平,但對(duì)HMGB1的表達(dá)無(wú)影響,提示高鈣離子刺激HK-2 細(xì)胞MCP-1的生成與自噬有關(guān),而HMGB1的生成則與自噬無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。結(jié)合以往研究結(jié)果,炎性因子MCP-1的生成可通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激[2]和自噬兩個(gè)途徑進(jìn)行。

    有關(guān)自噬對(duì)于器官的作用目前仍是有爭(zhēng)議的。在腎缺血再灌注性損傷中,有文獻(xiàn)報(bào)道自噬是腎臟保護(hù)因素,也有文獻(xiàn)報(bào)道自噬加重腎臟的損傷[18,21]。目前認(rèn)為在復(fù)雜的不同信號(hào)通路之間,細(xì)胞自噬不僅具有保護(hù)作用,同時(shí)也能促進(jìn)細(xì)胞死亡[21-22]。最近,有研究發(fā)現(xiàn),暴露在草酸鈣晶體之下的腎小管上皮細(xì)胞自噬增多,提示自噬在草酸鈣晶體導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞損傷中起重要作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn),使用CQ抑制細(xì)胞自噬后,高鈣離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率也明顯降低,細(xì)胞活性增加。本研究結(jié)果間接表明,高鈣離子誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)及細(xì)胞死亡。抑制自噬可能對(duì)處于高鈣離子環(huán)境的腎小管上皮細(xì)胞起保護(hù)作用,減少炎癥反應(yīng),進(jìn)而減少草酸鈣腎結(jié)石的形成。

    綜上所述,HK-2細(xì)胞在高鈣離子環(huán)境下炎癥因子MCP-1、 HMGB1表達(dá)增多,細(xì)胞自噬水平上調(diào)。抑制細(xì)胞自噬能夠減少細(xì)胞MCP-1的表達(dá),改善細(xì)胞活力,但對(duì)HMGB1表達(dá)無(wú)明顯影響。仍需要進(jìn)一步研究自噬與各炎癥因子相互作用并參與腎結(jié)石形成的具體機(jī)制。臨床上能否通過(guò)調(diào)控自噬來(lái)控制炎癥以達(dá)到預(yù)防和治療腎結(jié)石的目的,值得期待。

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