陳 宸 石森林(指導(dǎo))
浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053
本研究以慈溪和桐廬兩個(gè)產(chǎn)地浙麥冬為研究對(duì)象,通過高通量測序手段研究浙麥冬根際與非根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)與多樣性差異,為浙麥冬根際微生態(tài)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時(shí)為進(jìn)一步研究浙麥冬對(duì)根際微生態(tài)的影響機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1.1 樣本采集:于2018年9月在慈溪(CX)和桐廬(TL)浙麥冬產(chǎn)區(qū)進(jìn)行樣品采集,在二年生浙麥冬種植區(qū)域均勻選取3個(gè)采樣點(diǎn),每個(gè)采樣點(diǎn)通過五點(diǎn)取樣法采集樣本。將浙麥冬植株連根拔起,抖落根系外圍的大塊土壤,利用1L磷酸緩沖液清洗得到粘附在根部的土壤作為根際土壤(G),在植株附近無植物生長的地方取20cm深處土壤作為非根際土壤(FG),將從兩個(gè)產(chǎn)區(qū)采集到的各兩種土壤樣本分別標(biāo)記為:慈溪根際土壤(CXG)、慈溪非根際土壤(CXFG)、桐廬根際土壤(TLG)和桐廬非根際土壤(TLFG)。將同類樣本混合均勻,使用qigen DNAeasy powerSoil kit試劑盒(qigen公司,美國)按說明書提取獲得DNA,使用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)檢測濃度,通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完整性。
1.2 16SrDNA基因擴(kuò)增及Ion Torrent S5測序:采用引物341F/806R(341F:CCTAYGGGRBGCASCAG;806R:GGACTACNNGGGTATCTAAT)擴(kuò)增16SrDNA V3-V4可變區(qū)片段。PCR擴(kuò)增程序如下:95℃for 3 minutes;35cycles of:-95℃ for 30 seconds;-58℃ for 30 seconds;-72℃ for 30 seconds;-72℃for 5 minutes;獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠篩選純化,得到PCR產(chǎn)物。將每個(gè)樣品等比例混合后,依托Thermo Fisher Scientific公司Ion Torrent S5平臺(tái)進(jìn)行測序(由浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限有限公司提供)。
1.3 數(shù)據(jù)分析:測序得到的raw data,通過生物信息分析去除接頭和barcode序列;然后使用QIIME軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,過濾掉含N較多或者低質(zhì)量序列,最后進(jìn)行嵌合體過濾,得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(序列平均長度在420bp左右),利用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部Effective Tags進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs,同時(shí)會(huì)選取OTUs的代表性序列,依據(jù)其算法原則,篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋,用uclust方法與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析,并分別在各個(gè)分類水平:kingdom(界),phylum(門),class(綱),order(目),family(科),genus(屬),species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用PyNAST軟件與Silva數(shù)據(jù)庫中的“Core Set”數(shù)據(jù)信息進(jìn)行快速多序列比對(duì),得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理,以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理,后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。使用QIIME 軟件計(jì)算 Observed-species,Chao1,Shannon,Simpson,ACE,Goods-coverage指數(shù),使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析;Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析選用T-test檢驗(yàn)。
2.1 根際與非根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)比較:將4種土壤樣本的Effective Tags進(jìn)行聚類,以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。對(duì)OTU數(shù)量進(jìn)行比較,未發(fā)現(xiàn)顯著差異。通過Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)比較不同土壤微生物Alpha多樣性,無顯著差異。詳見表1。
表1 四種土壤樣本細(xì)菌多樣性指數(shù)
表2 CXG與CXFG的Fisher樣本間物種差異分析
表3 TLG與TLFG的Fisher樣本間物種差異分析
圖1 門水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖
2.2 細(xì)菌群落組成及多樣性分析:CXG、CXFG、TLG、TLFG四種土壤分別有27、27、24和27個(gè)門類菌群。根據(jù)物種注釋結(jié)果,四種土壤中豐度最大的十個(gè)門類相同,分別是:Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Patescibacteria、Latescibacteria、Cyanobacteria(藍(lán)藻門)和Nitrospirae(硝化螺旋菌門)。從圖1可以看出,Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Patescibacteria和Cyanobacteria(藍(lán)藻門)在根際土壤中的相對(duì)豐度明顯高于在非根際土壤中,而Acidobacteria(酸桿菌門)和Actinobacteria(放線菌門)的相對(duì)豐度在兩者間基本持平,Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、LatescibacteriaNitrospirae(硝化螺旋菌門)在非根際土壤中的相對(duì)豐度則明顯高于在根際土壤中。
2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析:將4種土壤樣本的OTU分布進(jìn)行Venn圖分析,4種土壤中均有分布的OTU數(shù)量為600,TLG與TLFG共有OTU數(shù)量為1093,CXG與CXFG共有OTU數(shù)量為967,TLG與CXG共有OTU數(shù)量為827,TLFG與CXFG共有OUT數(shù)量為903,4種土壤依獨(dú)有OUT數(shù)量由高到低次序?yàn)椋篊XFG(155)、TLG(117),TLFG(93),CXG(68)。在屬分類水平上對(duì)四種土壤樣本進(jìn)行CXG與CXFG、TLG與TLFG樣本間Fisher檢驗(yàn),找出差異顯著的物種。在CXG與CXFG可鑒定到屬的266個(gè)屬中有顯著差異的(P<0.05)有147個(gè),在TLG與TLFG可鑒定到屬的254個(gè)屬中有顯著差異的(P<0.05)有112個(gè)。取差異最顯著的前10個(gè)屬展示,見表2、表3。
麥冬作為重要的常用中藥材,最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載,曰其“氣味甘、平,無毒”“久服輕身不老,不饑”。有臨床報(bào)道,沙參麥冬湯能夠延長非小細(xì)胞肺癌患者無進(jìn)展生存期,并能顯著改善患者生活質(zhì)量[1]。而麥冬的藥效往往與其產(chǎn)地有關(guān)。植物通過根系向土壤分泌有機(jī)物質(zhì)影響土壤微生物,受到這種影響的土壤區(qū)域稱為根際。以往研究表明,在麥冬生長期間,麥冬根系向根外不斷分泌有機(jī)物質(zhì),這些有機(jī)物質(zhì)對(duì)根際土壤微生物的物種結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生影響[2]。而根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化反過來會(huì)對(duì)土壤肥力和植物生長產(chǎn)生重要影響[3]。本研究發(fā)現(xiàn),根際土壤細(xì)菌與非根際土壤細(xì)菌在門和屬水平上結(jié)構(gòu)存在明顯差異,特別是屬水平上物種差異明顯。麥冬根系對(duì)黃桿菌屬、假單胞桿菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬、亞桿菌屬和腸桿菌屬這些反硝化細(xì)菌有明顯選擇性,與水稻情況基本相似[4]。值得注意的是,慈溪與桐廬兩地非根際土壤可能因受自然條件、土壤理化性質(zhì)的影響,細(xì)菌物種數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)有明顯差異,但兩地根際土壤根際土壤細(xì)菌物種數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)明顯趨近。這表明浙麥冬根系分泌物對(duì)根際土壤細(xì)菌的種類和群落結(jié)構(gòu)有明顯調(diào)控作用。