浙麥冬根際及非根際細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與多樣性研究

陳 宸 石森林（指導(dǎo)）

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

本研究以慈溪和桐廬兩個(gè)產(chǎn)地浙麥冬為研究對(duì)象，通過高通量測(cè)序手段研究浙麥冬根際與非根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)與多樣性差異，為浙麥冬根際微生態(tài)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步研究浙麥冬對(duì)根際微生態(tài)的影響機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集：于2018年9月在慈溪（CX）和桐廬（TL）浙麥冬產(chǎn)區(qū)進(jìn)行樣品采集，在二年生浙麥冬種植區(qū)域均勻選取3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)通過五點(diǎn)取樣法采集樣本。將浙麥冬植株連根拔起，抖落根系外圍的大塊土壤，利用1L磷酸緩沖液清洗得到粘附在根部的土壤作為根際土壤（G），在植株附近無植物生長(zhǎng)的地方取20cm深處土壤作為非根際土壤（FG），將從兩個(gè)產(chǎn)區(qū)采集到的各兩種土壤樣本分別標(biāo)記為：慈溪根際土壤（CXG）、慈溪非根際土壤（CXFG）、桐廬根際土壤（TLG）和桐廬非根際土壤（TLFG）。將同類樣本混合均勻，使用qigen DNAeasy powerSoil kit試劑盒（qigen公司，美國(guó)）按說明書提取獲得DNA，使用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完整性。

1.2 16SrDNA基因擴(kuò)增及Ion Torrent S5測(cè)序：采用引物341F/806R(341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT)擴(kuò)增16SrDNA V3-V4可變區(qū)片段。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃for 3 minutes；35cycles of：-95℃ for 30 seconds；-58℃ for 30 seconds；-72℃ for 30 seconds；-72℃for 5 minutes；獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠篩選純化，得到PCR產(chǎn)物。將每個(gè)樣品等比例混合后，依托Thermo Fisher Scientific公司Ion Torrent S5平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（由浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限有限公司提供）。

1.3 數(shù)據(jù)分析：測(cè)序得到的raw data，通過生物信息分析去除接頭和barcode序列；然后使用QIIME軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾掉含N較多或者低質(zhì)量序列，最后進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)（序列平均長(zhǎng)度在420bp左右），利用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時(shí)會(huì)選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用uclust方法與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析，并分別在各個(gè)分類水平：kingdom（界），phylum（門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用PyNAST軟件與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Core Set”數(shù)據(jù)信息進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。使用QIIME 軟件計(jì)算 Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage指數(shù)，使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析；Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析選用T-test檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 根際與非根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)比較：將4種土壤樣本的Effective Tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。對(duì)OTU數(shù)量進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)顯著差異。通過Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)比較不同土壤微生物Alpha多樣性，無顯著差異。詳見表1。

表1 四種土壤樣本細(xì)菌多樣性指數(shù)

表2 CXG與CXFG的Fisher樣本間物種差異分析

表3 TLG與TLFG的Fisher樣本間物種差異分析

圖1 門水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖

2.2 細(xì)菌群落組成及多樣性分析：CXG、CXFG、TLG、TLFG四種土壤分別有27、27、24和27個(gè)門類菌群。根據(jù)物種注釋結(jié)果，四種土壤中豐度最大的十個(gè)門類相同，分別是：Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Patescibacteria、Latescibacteria、Cyanobacteria（藍(lán)藻門）和Nitrospirae（硝化螺旋菌門）。從圖1可以看出，Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Patescibacteria和Cyanobacteria（藍(lán)藻門）在根際土壤中的相對(duì)豐度明顯高于在非根際土壤中，而Acidobacteria（酸桿菌門）和Actinobacteria（放線菌門）的相對(duì)豐度在兩者間基本持平，Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、LatescibacteriaNitrospirae（硝化螺旋菌門）在非根際土壤中的相對(duì)豐度則明顯高于在根際土壤中。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析：將4種土壤樣本的OTU分布進(jìn)行Venn圖分析，4種土壤中均有分布的OTU數(shù)量為600，TLG與TLFG共有OTU數(shù)量為1093，CXG與CXFG共有OTU數(shù)量為967，TLG與CXG共有OTU數(shù)量為827，TLFG與CXFG共有OUT數(shù)量為903，4種土壤依獨(dú)有OUT數(shù)量由高到低次序?yàn)椋篊XFG（155）、TLG（117），TLFG（93），CXG（68）。在屬分類水平上對(duì)四種土壤樣本進(jìn)行CXG與CXFG、TLG與TLFG樣本間Fisher檢驗(yàn)，找出差異顯著的物種。在CXG與CXFG可鑒定到屬的266個(gè)屬中有顯著差異的（P＜0.05）有147個(gè)，在TLG與TLFG可鑒定到屬的254個(gè)屬中有顯著差異的（P＜0.05）有112個(gè)。取差異最顯著的前10個(gè)屬展示，見表2、表3。

3 討論

麥冬作為重要的常用中藥材，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，曰其“氣味甘、平，無毒”“久服輕身不老，不饑”。有臨床報(bào)道，沙參麥冬湯能夠延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌患者無進(jìn)展生存期，并能顯著改善患者生活質(zhì)量[1]。而麥冬的藥效往往與其產(chǎn)地有關(guān)。植物通過根系向土壤分泌有機(jī)物質(zhì)影響土壤微生物，受到這種影響的土壤區(qū)域稱為根際。以往研究表明，在麥冬生長(zhǎng)期間，麥冬根系向根外不斷分泌有機(jī)物質(zhì)，這些有機(jī)物質(zhì)對(duì)根際土壤微生物的物種結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生影響[2]。而根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化反過來會(huì)對(duì)土壤肥力和植物生長(zhǎng)產(chǎn)生重要影響[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤細(xì)菌與非根際土壤細(xì)菌在門和屬水平上結(jié)構(gòu)存在明顯差異，特別是屬水平上物種差異明顯。麥冬根系對(duì)黃桿菌屬、假單胞桿菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬、亞桿菌屬和腸桿菌屬這些反硝化細(xì)菌有明顯選擇性，與水稻情況基本相似[4]。值得注意的是，慈溪與桐廬兩地非根際土壤可能因受自然條件、土壤理化性質(zhì)的影響，細(xì)菌物種數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)有明顯差異，但兩地根際土壤根際土壤細(xì)菌物種數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)明顯趨近。這表明浙麥冬根系分泌物對(duì)根際土壤細(xì)菌的種類和群落結(jié)構(gòu)有明顯調(diào)控作用。