解毒祛瘀滋陰方對H22荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫功能的影響

張婷婷 周琢艷 李俊峰 劉文洪

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

解毒祛瘀滋陰方是范永升教授治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床經(jīng)驗方，本實驗探討其對荷瘤小鼠腫瘤生長及其免疫功能的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及H22瘤株：昆明小鼠雄性24只，4～6周齡，體質(zhì)量18～22g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。實驗動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184。H22瘤株購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。

1.2 藥材與試劑：解毒祛瘀滋陰方由干地黃、白花蛇舌草、積雪草、薏苡仁各12g，鱉甲、青蒿、赤芍各10g，升麻20g，佛手8g，甘草6g等藥物組成，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部。5-氟尿嘧啶（5-FU）、小鼠白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、ELISA檢測試劑盒購自上海源葉生物有限公司。

2 實驗方法

2.1 模型制備及分組：實驗用小鼠均按常規(guī)方法接種腫瘤細胞，取自行小鼠腹腔傳代7天的H22瘤株，無菌條件下抽取生長良好的乳白色腹水液，以0.9%氯化鈉溶液1:1稀釋，經(jīng)0.2%臺盼藍染色后計算活細胞數(shù)＞95%，調(diào)整瘤細胞懸液為1×108個/ml瘤細胞，以每只0.2ml的劑量接種于小鼠右側(cè)腋窩下。接種次日將小鼠隨機分為3組：病理模型組、五氟尿嘧啶（陽性藥）組、解毒祛瘀滋陰方（中藥）組，每組8只。

2.2 藥物制備及給藥方法：將解毒祛瘀滋陰方以10倍水煎煮2h，過濾；等體積水再次煎煮2h，過濾；合并濾液，并濃縮至含藥量1g/ml。根據(jù)人與小鼠藥物劑量換算公式算出小鼠每日給藥劑量。病理模型組予以生理鹽水20ml/kg，每日1次；陽性藥組腹腔注射五氟尿嘧啶0.1ml/10g，每日1次；解毒祛瘀滋陰方（中藥）組予以18mg/kg濃縮液灌胃，每日1次。連續(xù)給藥10天。

2.3 體質(zhì)量及腫瘤生長：于給藥前和停藥24h后以分析天平各測體質(zhì)量1次。末次給藥24h各組小鼠眼球采血后，以頸椎脫臼法處死，從腋部皮下完整剝離腫瘤組織，稱量腫瘤質(zhì)量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（病理模型組平均瘤質(zhì)量-實驗組平均瘤質(zhì)量）/病理模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.4 免疫器官指數(shù)的測定：小鼠處死后快速剝離脾臟和胸腺并稱質(zhì)量，計算脾臟和胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/動物質(zhì)量。

2.5 小鼠血清IL-2、TNF-α含量的測定：給藥10d后，實體瘤小鼠摘眼球取血0.5～1.0ml，4℃3000r/min離心15min，取血清置于-20℃保存，IL-2、TNF-α試劑盒測定。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 解毒祛瘀滋陰方對H22荷瘤小鼠實體瘤生長的影響：與病理模型組對比，解毒祛瘀滋陰方組給藥后體質(zhì)量明顯增高，瘤質(zhì)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與五氟尿嘧啶組對比，解毒祛瘀滋陰方組給藥后體質(zhì)量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），瘤質(zhì)量無明顯差異。提示解毒祛瘀滋陰方組能抑制H22實體瘤的生長。陽性藥組與解毒祛瘀滋陰方組抑瘤率均達到30%以上，說明五氟尿嘧啶與解毒祛瘀滋陰方對腫瘤生長具有明顯抑制。詳見表1。

表1 解毒祛瘀滋陰方對H22實體瘤生長的影響（±s）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05；與陽性藥組比較，ΔP＜0.05。

抑瘤率-45.91%76.28%組別病理模型組陽性藥組中藥組例數(shù)8 8 8體質(zhì)量（g）給藥前27.78±0.96 26.85±0.95 27.82±1.57給藥后38.50±0.54 40.15±2.12 43.78±3.22*Δ瘤質(zhì)量（g）1.89±0.70 1.10±0.45 0.44±0.22*

3.2 解毒祛瘀滋陰方對H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響：與病理模型組對比，解毒祛瘀滋陰方組胸腺指數(shù)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與病理模型組對比，五氟尿嘧啶組胸腺指數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與五氟尿嘧啶組對比，解毒祛瘀滋陰方組胸腺指數(shù)顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而脾臟指數(shù)病理模型組、解毒祛瘀滋陰方組與陽性藥組均無明顯差異。詳見表2。

表2 H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)（±s，%）

表2 H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)（±s，%）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，ΔΔP＜0.01。

脾臟指數(shù)63.20±7.22 80.40±13.84 77.42±13.10組別病理模型組陽性藥組中藥組例數(shù)8 8 8胸腺指數(shù)22.03±2.14 10.16±3.10**32.82±6.54*ΔΔ

3.3 ELISA法測定細胞因子：與病理模型組和五氟尿嘧啶組對比，解毒祛瘀滋陰方組明顯提高血清中IL-2和TNF-α水平（P＜0.05）。五氟尿嘧啶組與病理模型組對比并無明顯差異。詳見表3。

表3 ELISA法測定細胞因子（±s，pg/ml）

表3 ELISA法測定細胞因子（±s，pg/ml）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，ΔΔP＜0.01。

TNF-α 82.67±1.15 81.00±3.01 89.95±5.53**ΔΔ組別病理模型組陽性藥組中藥組例數(shù)8 8 8 IL-2 30.59±4.00 28.60±4.02 41.11±8.12*ΔΔ

4 討論

前期研究表明解毒祛瘀滋陰方可以增強RAW264.7巨噬細胞吞噬功能，調(diào)節(jié)免疫功能[1]，故進一步探討解毒祛瘀滋陰方的抗腫瘤功效。該方以干地黃清熱涼血益陰為君，白花蛇舌草、升麻清熱解毒消斑為臣，炙鱉甲補陰益腎退熱，赤芍、積雪草活血散血俱為佐藥，青蒿退熱，芳香體輕，開胃養(yǎng)脾，疏理少陽氣機，炒薏苡仁、佛手片、生甘草調(diào)和脾胃，疏理氣機，調(diào)和諸藥為使。諸藥合用，共奏清熱解毒、活血化瘀、益腎養(yǎng)陰之功，為腫瘤的治療提供了新的方向。

本實驗結(jié)果表明，解毒祛瘀滋陰方對荷瘤小鼠的實體瘤生長具有明顯抑制作用，并提高其血清細胞因子IL-2、TNF-α水平。IL-2是T細胞在體外生長所必需的細胞因子，它可促進已活化的T細胞增殖分化成熟為效應(yīng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)T細胞和細胞毒性T細胞(CTL)，并可調(diào)節(jié)B細胞、NK細胞和巨噬細胞的免疫功能[2]。腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)往往對各種抗原沒有反應(yīng)，增殖活性低下，加入IL-2后可以逆轉(zhuǎn)這種無反應(yīng)狀態(tài)以證明其在腫瘤免疫過程中起到良好作用[3]。TNF-α是細菌脂多糖作用于單核巨噬細胞釋放的一種多肽類物質(zhì)，對腫瘤有直接溶解和抗腫瘤作用，還能增強炎癥部位單核巨噬細胞系統(tǒng)活性及NK細胞的細胞毒作用[4]。解毒祛瘀滋陰方組通過增強IL-2、TNF-α釋放，以達到調(diào)節(jié)T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等免疫相關(guān)細胞功能，逆轉(zhuǎn)TIL的無反應(yīng)狀態(tài)，并作用于血管內(nèi)皮細胞，損傷內(nèi)皮細胞或?qū)е卵芄δ芪蓙y，使血管損傷和血栓形成，造成腫瘤組織的局部血流阻斷而發(fā)生出血、缺氧壞死，起到直接殺傷或抑制腫瘤作用。陽性組藥物5-FU為抗代謝藥物，對胸腺骨髓有著明顯抑制作用，而解毒祛瘀滋陰方在抑制腫瘤生長的同時，增強其胸腺指數(shù)，調(diào)節(jié)其免疫功能。其在抗腫瘤免疫中所起的重要作用，為腫瘤治療提供新的科研方向，并為臨床用藥提供新的思路與方法。但實驗仍存在不足之處，動物腫瘤模型存在個體差異會影響實驗結(jié)果，后續(xù)仍需繼續(xù)進一步研究。