特基拉芽胞桿菌B05高密度發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件優(yōu)化

張翠綿， 蘭澤君， 彭杰麗， 胡 棟， 魏曉燕， 賈 楠， 黃曉東， 王占武*

(1. 河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所 河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點實驗室，河北 石家莊 050051; 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210014)

我國有鹽堿地9 913萬hm2，其中環(huán)渤海70萬hm2，是重要的潛在耕地資源[1]，實施改良利用是提高糧食產(chǎn)能、改善區(qū)域生態(tài)環(huán)境、提高農(nóng)民收入的重要途經(jīng)。世界各國都在努力尋找鹽堿地改良的科學(xué)方法，目前可應(yīng)用的方法有：①以水壓鹽種植水稻[2-4]，該方法當年可見效，但僅限于水源豐富的地區(qū)；②采用耕作措施，切斷土壤毛細管，控制水分毛細管運動，阻止鹽分向地表運動[4-5]，但僅限于作物生長前使用；③土壤改良劑，目前主要利用有機或無機材料，如草炭、腐殖酸、脫硫煙灰等中和或吸附作用改良鹽堿耕地[6-7]，但材料用量大，成本高，也受地方資源的限制；④微生物改良方法，根際接種功能微生物，提高植物耐鹽性，目前研究和應(yīng)用較多的是菌根菌[8]，由于菌根菌的人工繁殖難度較大，限制了規(guī)模應(yīng)用，因而菌劑生產(chǎn)性能優(yōu)良的根際細菌的利用受到世界各國學(xué)者的關(guān)注[9-10]。本研究采用植物與微生物聯(lián)合改良鹽堿地思路，從鹽堿低產(chǎn)田小麥根際篩選獲得了1株與冬小麥具有良好融合關(guān)系的特基拉芽胞桿菌B05，在海興縣中低產(chǎn)田小麥上應(yīng)用，可顯著提高小麥的耐鹽和耐旱能力，產(chǎn)量提高7%～9%(另文發(fā)表)，具有廣闊應(yīng)用潛力。特基拉芽胞桿菌具有抗菌、促生的作用已有報道[11-13]，但應(yīng)用于鹽堿土壤改良尚屬首次。前期研究發(fā)現(xiàn)，菌株B05的擴繁能力較弱，采用常規(guī)細菌培養(yǎng)基，活菌濃度在108cfu/mL水平上。為促進該菌的轉(zhuǎn)化應(yīng)用，本研究進行高密度發(fā)酵條件的研究，同時在10 L發(fā)酵罐水平上進行試驗，以達到預(yù)期效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 特基拉芽胞桿菌(Bacillustequilensis)B05菌株，由河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA 固體培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù)，%)：牛肉浸膏0.3，蛋白胨1 ，葡萄糖0.25，瓊脂1.8，調(diào)pH 值為7.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，用于B05菌株活化和培養(yǎng)；NB液體培養(yǎng)基組分：不加瓊脂的NA培養(yǎng)基，用于B05菌株種子液培養(yǎng)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市中聯(lián)，HZQ-F160)；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊，YXQ-SG46-280S)；電子天平(北京賽多利斯，F(xiàn)C104)；pH計(上海盛磁，PHS-25)；生化培養(yǎng)箱(上海博訊，SPX-250B-Z)；超凈工作臺(上海博訊，SW-CJ-1F)。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將保存于斜面培養(yǎng)基上的特基拉芽胞桿菌B05活化，37 ℃培養(yǎng)24 h，于 4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 種子液制備 將50 mL NB培養(yǎng)液置于250 mL錐形瓶中，滅菌，接入1環(huán)活化后的B05菌種，37 ℃、180 r/min，培養(yǎng)24 h。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 取50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，滅菌后接入1 mL B05芽胞桿菌種子液，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.4 總活菌量和芽胞量測定 采用平板計數(shù)法[14]測總活菌量。芽胞量測定：將發(fā)酵液于80 ℃水浴中保持10 min，再用檢測活菌方法測定。以活菌總量作為培養(yǎng)基優(yōu)化評判標準。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 ①碳源的篩選優(yōu)化：分別以甘油、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖和玉米淀粉相等質(zhì)量替代NB培養(yǎng)基中的碳源，其他成分不變[15-16]。在裝有100 mL(250 mL三角瓶中)NB培養(yǎng)液的三角瓶中，接3%種子液，放于恒溫(37 ℃)搖床(180 r/min)培養(yǎng)24 h，取樣測定發(fā)酵液活菌數(shù)和芽胞數(shù)，每處理重復(fù)3次，確定最佳碳源。②氮源的篩選優(yōu)化：以①中篩選的碳源為基礎(chǔ)，分別以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、豆粕、麩皮、KNO3和(NH4)2SO4相等質(zhì)量替代NB培養(yǎng)基中的氮源，其他同上，每處理重復(fù)3次，確定最佳氮源。③無機鹽的篩選：在上述篩選的碳源和氮源的基礎(chǔ)上，分別添加0.5%的FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4、KH2PO4、K2HPO4+KH2PO4、K2HPO4+KH2PO4+MnSO4·H2O和NaCl，其他條件同上，每處理重復(fù)3次，確定最佳無機鹽種類或組合。

1.2.6 多因素正交試驗 以上述實驗篩選出的最佳碳、氮、無機鹽為變異因子，采用L9(34)正交表，進行優(yōu)化試驗，確定各組分最佳配比[17]。

1.2.7 菌株B05發(fā)酵條件優(yōu)化 以上述優(yōu)化的各因素及配比確定發(fā)酵培養(yǎng)基[18-19]，以測定發(fā)酵液活菌數(shù)為依據(jù),對溫度(A)、初始pH值(B)、轉(zhuǎn)速(C)、接種量(D)和裝液量(E)5個因素進行L16(45)正交試驗,確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.8 發(fā)酵罐(10 L)擴大培養(yǎng) 釆用液體發(fā)酵罐(10 L)，配培養(yǎng)液7 L,液體種子培養(yǎng)及接種量均同搖瓶試驗。發(fā)酵條件：通氣量400 L/h，轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵過程的溶氧控制在20%以上，罐壓保持在0.03～0.05 MPa,初始pH為7.0。每2 h取樣，測活菌數(shù)，繪制生長曲線。

1.2.9 活菌發(fā)酵液對小麥(小偃60)苗的影響 取含鹽0.4 %的鹽堿地土壤裝入塑料盆中，試驗設(shè)空白對照(以蒸餾水代替菌劑)、陽性對照(以滅菌液體培養(yǎng)基代替菌劑)、發(fā)酵菌液3個處理。挑選萌發(fā)整齊一致的小麥種子栽入盆中，每盆4棵，每處理重復(fù)6次，置于大棚溫室內(nèi)，第一次利用稱重法澆水或菌劑(菌劑濃度為2×108cfu/mL)，之后用稱重法澆水，其他管理措施一致。培養(yǎng)30 d，測定小麥根長和株高，將小麥根、莖105 ℃殺青30 min，80 ℃烘至恒重，稱莖干重和根干重。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 處理間差異顯著性(F=MSA/MSe)分析用F檢驗法進行；用鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對菌株B05液體發(fā)酵的影響

由圖1可知，不同碳源對菌株B05活菌量均有一定影響，以麥芽浸粉為碳源的發(fā)酵液活菌量和芽胞數(shù)最大，分別為7.5×108cfu/mL和5.5×108cfu/mL，其次為可溶性淀粉和玉米淀粉，其他碳源發(fā)酵水平較低。因此選用麥芽浸粉作為培養(yǎng)基碳源。

圖1 不同碳源對菌株B05發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the fermentation of Bacillus tequilensis B05

2.2 不同氮源對菌株B05液體發(fā)酵水平的影響

圖2結(jié)果表明，使用酵母浸粉菌株B05的活菌量和芽胞數(shù)最多，分別為7.43×108和5.8×108cfu/mL，其次為蛋白胨和胰蛋白胨，且兩者間無顯著性差異，并且兩者的芽胞數(shù)較其對應(yīng)的活菌數(shù)較高，其他無機氮源發(fā)酵水平較低。因此從營養(yǎng)成分的互補和節(jié)約成本考慮，選用胰蛋白胨、酵母浸粉作為培養(yǎng)基氮源。

圖2 不同氮源對菌株B05發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of Bacillus tequilensis B05

2.3 不同無機鹽對菌株B05發(fā)酵水平的影響

由圖3可知，以麥芽浸粉為碳源，酵母浸粉、胰蛋白胨為氮源，不同無機鹽對菌株B05活菌數(shù)的影響不同。添加MnSO4·H2O的組別，其活菌數(shù)和芽胞數(shù)分別為5.5×108和4.4×108cfu/mL，芽胞生成率最高；添加復(fù)合鹽(質(zhì)量比)KH2PO4∶K2HPO4∶MnSO4·H2O=1∶1∶1的組別，活菌數(shù)和芽胞數(shù)顯著高于其他無機鹽類，分別為1.1×109cfu/mL和8.1×108cfu/mL，其余組別較低。可見KH2PO4與K2HPO4兩者利于細胞生長，MnSO4·H2O對芽胞形成有促進作用。因此選擇KH2PO4∶K2HPO4∶MnSO4·H2O=1∶1∶1作為培養(yǎng)液的無機鹽(圖3)。

圖3 不同無機鹽對菌株B05發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different inorganic elements on the fermentation of Bacillus tequilensis B05

2.4 培養(yǎng)基配比的優(yōu)化

通過上述碳源、氮源以及無機鹽單因素試驗的研究，確定了B05菌株液體發(fā)酵的最佳組分，為進一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，選用4因素3水平的L9(34)正交表設(shè)計，以活菌數(shù)為標準，確定各組分的最佳配比。其因素和水平見表1。試驗結(jié)果(表2)表明，不同組分對菌株B05發(fā)酵影響程度為N>S>P>M，最佳組合為M2N2P3S1，活菌數(shù)最高達6.03×109cfu/mL，因此，菌株B05發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方(質(zhì)量分數(shù)，%)：麥芽浸粉1，酵母浸粉2，胰蛋白胨2，無機鹽0.3(質(zhì)量比：KH2PO4∶K2HPO4∶MnSO4·H2O=1∶1∶1)。

表1 B05菌株正交試驗因素與水平

表2 正交試驗結(jié)果

注：上標字母為鄧肯式新復(fù)極差測驗結(jié)果(小寫字母α=0.05，大寫字母α=0.01)，表4、6同

2.5 菌株B05液體發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.5.1 液體種子的制備 將菌株B05接種于50 mL NB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

2.5.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化 以菌液活菌數(shù)為依據(jù)，選擇溫度(A)、pH(B)、轉(zhuǎn)速(C)、接種量(D)和裝液量(E)5個因素對菌株B05進行L16(45)正交試驗(表3)，從而確定菌株最優(yōu)發(fā)酵條件。優(yōu)化結(jié)果見表4。由表4可以看出，根據(jù)正交試驗結(jié)果進行極差分析可知，各因素對菌體生長影響主次順序為A>D>E>B>C，即溫度和接種量對菌株B05生長的影響較大，pH和裝液量的影響次之，轉(zhuǎn)速的影響最小，通過正交試驗，得到最佳組合為A2B1C3D4E2，通過正交表分析，得到理論最佳組合為A2B1C2D4E3。因此，需將兩組合進行二次平行試驗。

表3 L16(45)正交試驗設(shè)計表

2.5.3 搖瓶驗證試驗 將需驗證的兩組合進行搖床培養(yǎng)18 h，結(jié)果見表5。由表5可見，組合A2B1C3D4E2活菌數(shù)和芽胞數(shù)分別為9.3×1010和8.1×1010cfu/mL，正交試驗中產(chǎn)量最高的組合A2B1C2D4E3活菌數(shù)和芽胞數(shù)分別為6.8×1010和5.7×1010cfu/mL，組合A2B1C3D4E2比A2B1C2D4E3菌液活菌數(shù)和芽胞數(shù)分別提高了26.9%和29.6%。因此本研究培養(yǎng)菌株B05最優(yōu)條件為溫度30 ℃、pH 6.5、轉(zhuǎn)速200 r/min、接種量7%、裝液量40%。

表5 理論組合的試驗結(jié)果

2.6 最佳條件下菌株B05的生長曲線

采用上述優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進行搖瓶培養(yǎng)：將菌株B05以7%接種量接入搖瓶，30 ℃、200 r/min、裝液量40%、初始pH 6.5進行發(fā)酵培養(yǎng)。從接種的0 h開始，每隔2 h取菌液進行活菌數(shù)測定，平行操作3次，以活菌數(shù)為縱坐標，發(fā)酵時間為橫坐標，以活菌數(shù)的平均值繪制菌體生長曲線。從圖4可見，該菌株培養(yǎng)0～4 h為遲緩期，4～10 h為對數(shù)期，10～18 h為穩(wěn)定期，18 h后隨著培養(yǎng)時間的延長，營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物的大量積累，菌株進入衰退期。因此，要得到發(fā)酵液較高的活菌量可在18 h時終止培養(yǎng)。

圖4 菌株B05的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain B05

2.7 發(fā)酵罐(10 L)擴大培養(yǎng)

以搖瓶發(fā)酵為基礎(chǔ)，進行液體發(fā)酵罐(10 L)的擴大培養(yǎng)，發(fā)酵2 h開始第一次取樣，每隔2 h取發(fā)酵液，測定菌株B05活菌數(shù)。從圖5可以看出，0～8 h菌體活菌數(shù)少，8～10 h活菌數(shù)迅速增多，達到最大值；10～18 h活菌數(shù)穩(wěn)定在7.5×1010cfu/mL左右，18 h后活菌數(shù)漸少，菌體衰老加速，進入衰亡期。發(fā)酵罐(10 L)擴大培養(yǎng)與搖瓶發(fā)酵時間兩者基本一致。

2.8 發(fā)酵液對小麥耐鹽性的影響

以含鹽0.4%的鹽堿土壤為基質(zhì)，進行了小麥盆栽試驗。從表6可見，菌株B05發(fā)酵液處理的小麥根長、株高、莖干重和根干重均顯著提高(P<0.05)，全株生物量提高45.8%，說明菌株B05可顯著提高小麥植株的耐鹽性。

圖5 發(fā)酵罐(10 L)發(fā)酵過程曲線Fig.5 The fermentation process curve in fermentation tank(10 L)

處理株高/cm根長/cm根干重/mg莖干重/mg空白對照18.4cC13.2cC0.04cC0.20cC陽性對照20.3bB14.6bB0.05bB0.25bB發(fā)酵型菌劑22.4aA15.5aA0.06aA0.29aA

3 討 論

采用單一因素篩選試驗，明確麥芽浸粉、酵母浸粉、胰蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4和MnSO4·H2O對菌株B05擴繁具有較大影響。以上述物質(zhì)為基礎(chǔ)成分，利用正交試驗，優(yōu)化培養(yǎng)基配方(質(zhì)量分數(shù)，%)：麥芽浸粉1、酵母浸粉2、胰蛋白胨2和復(fù)合無機鹽0.3(質(zhì)量比：KH2PO4∶ K2HPO4∶ MnSO4·H2O =1∶ 1∶ 1)。由于在發(fā)酵過程中，高密度菌劑濃度除與菌種本身特性和培養(yǎng)基所含碳源、氮源、無機鹽種類及配比有關(guān)外，還與發(fā)酵工藝參數(shù)有關(guān)[20]，因此本研究采用L16( 45)正交試驗，優(yōu)化了發(fā)酵溫度、pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量等發(fā)酵條件對發(fā)酵水平的影響，確定最佳發(fā)酵條件為溫度30 ℃、pH 6.5、轉(zhuǎn)速200 r/min、接種量7%、裝液量40%，培養(yǎng)18 h，菌液活菌數(shù)達到9.3×1010cfu/mL，比優(yōu)化前活菌數(shù)提高了兩個數(shù)量級，發(fā)酵時間縮短2 h，降低能耗和生產(chǎn)成本明顯?？梢姡瑢ε囵B(yǎng)基和發(fā)酵條件的雙重優(yōu)化可較大幅度提高目的菌株的發(fā)酵水平。周映華等[21]通過對1株枯草芽胞桿菌發(fā)酵條件在三角瓶中進行優(yōu)化，發(fā)酵液中菌數(shù)最終達到1.26×109cfu/mL。

在10 L全自動液體發(fā)酵罐水平上進行了擴大培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)菌體生長曲線基本與搖瓶條件下一致，在18 h時處于穩(wěn)定期末期，芽胞生成率較高，適于菌體收獲。在實際生產(chǎn)中可以縮短生產(chǎn)周期、降低能耗，提高生產(chǎn)效率。在含鹽0.4%鹽堿土壤上進行了小麥盆栽試驗，發(fā)酵菌液可顯著提高小麥的耐鹽性，全株生物量提高45.8%，應(yīng)用效果顯著。本研究獲得的最佳參數(shù)具有用于規(guī)模發(fā)酵的可能性，下一步將進一步擴大發(fā)酵規(guī)模，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)。