水母雪蓮多糖對中波紫外線誘導的皮膚成纖維細胞凋亡的研究

孫楠 吳艷 姜莉

[摘要]目的：研究水母雪蓮多糖對中波紫外線刺激下人皮膚成纖維細胞凋亡的影響及可能的機制。方法：利用蒸餾水回流提取+醇沉分離法提取水母雪蓮中的多糖成分;使用包皮切除術后皮膚，處理后在6孔板中定量接種經10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)的細胞。細胞體外培養(yǎng)并分為空白對照組、紫外線照射組、10mg/ml水母雪蓮多糖干預組和40mg/ml水母雪蓮多糖干預組。除空白對照組外，其他組細胞分別在低輻射UVB（L-UVB，30mJ/cm2輻射1h）和高輻射UVB（H-UVB，60mJ/cm2輻射1h）兩種條件下接受紫外線照射。在暴露于UVB光前，10mg/ml水母雪蓮多糖干預組和40mg/ml水母雪蓮多糖干預組細胞以終濃度為10mg/ml和40mg/ml水母雪蓮多糖培養(yǎng)1h，紫外線組不干預。照射1h后，將細胞在37℃，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中溫育18h。測定SOD、GSH、CAT及MDA水平，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot測定p38、p53、Bcl-2、Bax蛋白及caspase-3的β肌動蛋白含量變化。結果：水母雪蓮多糖可以提高經中波紫外線損傷的成纖維細胞中SOD、CAT的活性和GSH含量，并可減少MDA含量，通過上調p38，p53和Bcl-2的表達，同時下調Bax和活性caspase-3的表達。與非干預組相比，無論暴露于低劑量還是高劑量輻射下，10mg/ml和40mg/ml水母雪蓮多糖組的成纖維細胞凋亡數目都要更少。結論：水母雪蓮多糖可以通過上調人成纖維細胞p38，p53和Bcl-2的表達、下調Bax和活性caspase-3的表達、增加SOD、CAT的活性和GSH的含量、減少MDA含量，從而抑制中波紫外線照射所致的細胞凋亡。

[關鍵詞]水母雪蓮多糖;中波紫外線;成纖維細胞;皮膚;誘導;凋亡

[中圖分類號]R329.2+8? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）03-0100-04

Abstract： Objective? To investigate the effect of Saussurea medusa Maxim polysaccharides on apoptosis of human fibroblasts exposed to UVB and to study possible mechanisms. Methods? Distilled water was used for reflux extraction and alcohol precipitation filtration method was used to extract Saussurea medusa Maxim polysaccharides. After skin was removed by foreskin， treated with 10% fetal bovine serum DMEM medium and inoculated in 96-well plates and 6-well plates for later use. Cells were cultured in vitro and divided into blank control group， ultraviolet irradiation group， 10mg/ml jellyfish jellyfish intervention group， and 40mg/ml jellyfish polysaccharide intervention group. Each group of cells was exposed to ultraviolet light under two conditions of low-irradiation UVB （L-UVB， 30mJ/cm2 radiation 1h） and high-radiation UVB （H-UVB，60mJ/cm2 radiation 1h）. Before exposed to UVB light， cells of the experimental group were cultured for 1 hour at a final concentration of 10mg/ml and 40mg/ml Saussurea medusa Maxim polysaccharides. The UV group did not interfere， and the blank control group did not receive irradiation. After 1 hour of irradiation， cells were incubated in 10% fetal bovine serum DMEM medium for 18 hours at 37℃. The levels of SOD， GSH， CAT and MDA were measured. Apoptosis was detected by flow cytometry. The changes of β-actin in p38， p53， Bcl-2， Bax and caspase-3 were determined by western blot. Results? The Saussurea medusa Maxim polysaccharides can increase the activity of SOD， CAT and the content of GSH in fibroblasts damaged by UVB， and decrease the content of MDA. The expression of p38， p53 and Bcl-2 was up-regulated， and the expression of Bax and active caspase-3 was down-regulated at the same time. No matter when exposed to low or high doses of radiation， the number of fibroblasts apoptosis in 10mg/ml and 40mg/ml Saussurea medusa Maxim polysaccharides group was lower than that in the control group. Conclusion? Saussurea involucrata can up-regulate p38， p53 and Bcl-2， down-regulate the expression of Bax and active caspase-3， and inhibit the expression of MDA by increasing SOD activity， GSH content， CAT activity and reducing MDA content. Irradiation leads to apoptosis of fibroblasts.

Key words： Saussurea medusa Maxim polysaccharides; medium wave ultraviolet; fibroblast; skin; induction; apoptosis

紫外線（UV）照射被認為在光老化和皮膚癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[1]。中波紫外線（UVB，290～320nm）可以透過表皮而影響真皮淺層，是自然環(huán)境中引起皮膚光損傷和光老化的重要因素之一，其主要靶細胞是成纖維細胞[2]。既往許多研究已經表明皮膚受大量紫外線照射后會引起諸多損害，如DNA/RNA損害[3]，絲裂原活化的蛋白激酶活化（MAPK）信號傳導級聯[4]，生產活性氧（ROS）[5]。經紫外線照射后，皮膚成纖維細胞的生長分化和功能等會發(fā)生明顯改變，并能夠增加成纖維細胞凋亡[6]。

水母雪蓮（Saussurea medusa Maxim）為菊科鳳毛菊屬的一種高山草本植物，是一種傳統(tǒng)中藥[7]。水母雪蓮具有除寒、壯陽、通經活血、清除自由基、抗疲勞及調節(jié)免疫功能等作用[8]，被廣泛用于類風濕性關節(jié)炎，胃痛，痛經等疾病的治療中[9]。水母雪蓮多糖中的多糖主要含有七種單糖：木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖，半乳糖醛酸和甘露糖，對陰離子自由基和羥基自由基具有明顯的清除作用[10]。研究表明[11]，水母雪蓮中多糖成分具有抗氧化作用，可提高小鼠組織中SOD活性和谷胱甘肽（GSH）含量，降低丙二醛（MDA）含量。本研究旨在研究水母雪蓮多糖對中波紫外線誘導的人成纖維細胞凋亡的影響及可能的機制，以提升皮膚的保護作用。

1? 材料和方法

1.1 水母雪蓮多糖的提取：使用80%乙醇溶液提取已經除去小分子糖類的干燥藥渣。以10倍于藥渣質量的蒸餾水回流提取3次，每次2h，提取完成后立即過濾，混合濾液后，減壓蒸發(fā)溶劑至適當體積。再使用活性炭進行熱回流脫色處理，加入乙醇，至乙醇終濃度為60%，冷藏條件下醇沉24h，離心得到淺黃色沉淀物粗多糖。加入無水乙醇至乙醇濃度為80%，繼續(xù)進行24h低溫醇沉，離心并收集沉淀物。使用蒸餾水再次溶解醇沉產物，使用Sevag法除去蛋白，確保終產物的茚三酮反應及碘反應均陰性。再次通過醇沉，獲得灰白色的多糖，經有機溶劑洗滌除雜，真空干燥后妥善保存。

1.2 主要材料和試劑：10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），達爾伯克氏改良伊格爾（Dulbeccos Modified Eagles Medium，DMEM）培養(yǎng)基（美國Gibco公司）。SOD、GSH、MDA、CAT試劑盒;p38、p53、Bcl-2、Bax蛋白、caspase-3的β肌動蛋白Western blot試劑盒均購置于中山金橋生物科技有限公司。流式細胞術檢測試劑盒來自BD公司。1 000W UVB輻照燈購置于上海Sigma-Aidrich貿易有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和分組：取筆者醫(yī)院泌尿科包皮切除術后皮膚，制成皮片后碘伏浸泡，再使用含青霉素（1×106U/L）、鏈霉素（100mg/L）的生理鹽水溶液漂洗，加入Dispase酶分離真皮及表皮，并除去表皮組織。剪碎真皮后37℃環(huán)境下以0.25%胰蛋白酶+0.1%乙二胺四乙酸再次消化分散細胞5min，采用200目尼龍網過濾溶液。在6孔板中定量接種經10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基傳代的細胞。

細胞體外培養(yǎng)并分成空白對照組，紫外線照射組，10mg/ml水母雪蓮多糖干預組，40mg/ml水母雪蓮多糖干預組。每組細胞分別在低輻射UVB（L-UVB，30mJ/cm2輻射1h）和高輻射UVB（H-UVB，60mJ/cm2輻射1h）兩種條件下接受紫外線照射。在暴露于UVB光前，實驗組細胞以終濃度為10mg/ml和40mg/ml水母雪蓮多糖培養(yǎng)1h，紫外線組不干預，空白對照組不接受照射。照射1h后，將細胞在37℃，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中溫育18h。

1.4 SOD，GSH，CAT和MDA水平的測定：在包含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中孵育18h后，按SOD試劑盒，GSH試劑盒，MDA試劑盒和CAT試劑盒使用說明書，分別測量相應化合物活性或濃度。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡：所有細胞在37℃和5% CO2下孵育，細胞在6孔板進行消化并用PBS洗滌，調整細胞濃度為106。離心后棄上清液。加入100μl膜聯蛋白結合緩沖液，細胞用5μl膜聯蛋白和1μl PI工作液孵育15min。使用膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）染色。用UV照射和LUT孵育之后，收集細胞并用冰冷的PBS洗滌2次，然后與膜聯蛋白V-FITC和PI一起溫育。使用流式細胞儀以480nm的激發(fā)波長通過FL-1濾膜（530nm）和FL-2濾膜（585nm）將細胞懸浮并進行流式細胞術檢測。

1.6 Western bolt：依照說明使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解培養(yǎng)基，并將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上，3%牛血清白蛋白封閉膜，在4℃下與第一抗體一起溫育過夜，然后在室溫下與辣根過氧化物酶標第二抗體溫育2h。使用化學發(fā)光試劑盒檢測p38、p53、Bcl-2、Bax蛋白、caspase-3的β肌動蛋白條帶，使用Image J 5.0軟件暴露于X射線膠片，測定密度。

1.7 統(tǒng)計學處理：SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，所有數據均以平均值±標準差（x?±s）表示，行t檢驗和單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 各組細胞SOD，GSH，CAT和MDA水平變化：與H-UVB組相比，L-UVB組SOD活性、GSH含量及CAT活性均顯著降低，MDA含量明顯增高（P<0.05）;10mg/ml多糖，40mg/ml多糖組的SOD活性，GSH含量及CAT活性均顯著升高，MDA含量顯著降低（P<0.05）;與10mg/ml多糖組比較，40mg/ml多糖時SOD活性，GSH含量和CAT活性顯著增加，MDA含量顯著降低（P<0.05）。各組SOD活性、GSH含量、CAT活性及MDA含量見圖1。

2.2 成纖維細胞凋亡水平測定：在低劑量和高劑量的UVB紫外線輻射下，與非藥物干預組相比，10mg/ml多糖和40mg/ml多糖組細胞凋亡細胞數量下降。見圖2。

2.3 Western bolt結果：與對照組相比，L-UVB組p38，p53和Bcl-2的表達顯著降低，Bax和活性caspase-3的表達顯著增加（P<0.05）;與UVB組比較，10mg/ml Bcl-2的表達顯著增加，Bax和活性caspase-3的表達顯著降低（P<0.05）。然而，與UVB組相比，10mg/ml時p38和p53的表達降低（P>0.05）;與UVB組相比，40mg/ml時p38，p53和Bcl-2的表達顯著增加，Bax和活性caspase-3的表達顯著降低;與10mg/ml組相比，40mg/ml組p53表達顯著增加，Bax表達顯著降低（P<0.05）。在H-UVB組，p38、p53和Bcl-2的表達顯著下降，Bax和活性胱天蛋白酶-3的表達與對照組相比顯著增加（P<0.05）;10mg/ml和40mg/ml組p53和Bcl-2的表達顯著增加，p38，Bax和活性caspase-3的表達顯著降低（P<0.05 ）;與10mg/ml組比較，40mg/ml組Bcl-2表達顯著增加，p38，p53，Bax和活性caspase-3表達顯著降低（P<0.05）。各組中的p38，p53，Bcl-2，Bax和caspase-3的Western blot結果，見圖3。

3? 討論

3.1 作為人體最大的器官，皮膚是機體固有免疫的重要組成部分，也是抵抗外界損害的第一道防線[12]。UVB照射通過產生ROS，誘導皮膚的氧化應激反應，導致細胞的抗氧化劑耗盡損傷皮膚組織和細胞組分（如脂質膜，蛋白質損傷和DNA），并可通過一系列機制導致細胞凋亡。CAT和SOD構成的酶促抗氧化防御系統(tǒng)，GSH蛋白通過減少最常見的自由基MDA引起的光老化來修復皮膚[13]。因此，筆者使用SOD活性，GSH含量，CAT活性和MDA含量作為這種損傷的指標來評估UVB照射后成纖維細胞的損傷程度。本研究發(fā)現，相比于單純紫外線照射組，水母雪蓮多糖增加了實驗組細胞的SOD活性，GSH含量，CAT活性并減少了MDA含量。這些結果表明，水母雪蓮多糖對UVB輻射的人成纖維細胞中的氧化損傷具有保護作用。

3.2 作為細胞受控的、程序性的死亡，凋亡對于生物體本身的生長發(fā)育和生命延續(xù)具有非常重要的生理意義。生物體可以通過凋亡的激活來清除老化或受損的細胞器及蛋白質，從而使生物體獲得更新[14]。生物體凋亡不足或過于激活都可能會導致某些疾病的產生和發(fā)展。以往研究證明，ROS在UVB處理的角質形成細胞中的積累可促進細胞凋亡，導致線粒體通透性轉換[15]。研究中也發(fā)現水母雪蓮多糖可以通過上調p38，p53和Bcl-2的表達，同時下調Bax和活性caspase-3的表達來抑制中波紫外線照射導致的成纖維細胞凋亡增加。

3.3 目前已報道了許多天然植物成分對UV和氧化應激損傷保護作用的相關研究。例如，在絞股藍中大量存在的絞股藍總皂苷，對紫外線A和UVB誘導的損傷具有光保護作用[16]。用白楊素預處理可以有效防止紫外線誘導的損傷，甚至可以減少細胞凋亡，ROS產生和環(huán)氧合酶2（COX-2）的表達[17]。這些提示人們應重視植物成分對紫外線光損傷和光老化的保護作用，充分挖掘傳統(tǒng)中醫(yī)藥寶貴財富。本項研究中對水母雪蓮多糖減少中波紫外線誘導成纖維細胞凋亡的作用機理研究還不夠深入，筆者將在后續(xù)的工作中繼續(xù)研究。

4? 結論

水母雪蓮多糖可以通過上調p38，p53和Bcl-2，下調Bax和活性caspase-3的表達并可以通過提高SOD活性，GSH含量，CAT活性及降低MDA含量來抑制中波紫外線照射導致的成纖維細胞凋亡。

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[收稿日期]2018-11-26

本文引用格式：孫楠，吳艷，姜莉.水母雪蓮多糖對中波紫外線誘導的皮膚成纖維細胞凋亡的研究[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（3）：100-103.