核酸適配體在微流控芯片中篩選及病毒性疾病中應用

向夢琦， 洪少力， 董浩宇， 龐代文， 張志凌*

(1.武漢大學化學與分子科學學院，生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室，湖北武漢430072； 2.武漢紡織大學電子與電氣工程學院，湖北武漢 430200)

1 前言

核酸適配體是能形成特定三級結構的寡核苷酸序列，其具有體積小、結構靈活、無毒性、穩(wěn)定性高、易化學修飾與功能化的特點?？蛇M行大量低成本合成[1]，特定的三級結構是其特異性結合的原因[2]。其親和力與抗體相比，解離常數(shù)Kd值大多數(shù)在nmol到pmol范圍內。核酸適配體的靶標小到無機離子[3]、有機分子[4]，大到蛋白質[5]、酶[6]、受體[7]、病毒[8]以及整個細胞[9]等，其在生物傳感[10]、影像探針[11]、靶向診斷與治療[12]等生物醫(yī)學基礎研究和疾病診斷領域得到廣泛應用。篩選針對靶標特異性核酸適配體的過程通?？煞譃槲鍌€重復步驟：結合、分離、洗脫、擴增和克隆測序。篩選后的核酸適配體可化學合成與高度純化，減少了抗體存在批次間差異的問題。自1990年Gold等[6]首次提出指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)以來，已引起研究者廣泛興趣，并有較多關于核酸適配體的篩選及其應用的報道。本文重點介紹核酸適配體在微流控芯片領域進行篩選的研究進展，以及闡述其在病毒性疾病的應用以及展望。

2 微流控SELEX

傳統(tǒng)SELEX篩選輪次多(一般10～20輪)，需要專業(yè)人員操作，是勞動密集型和時間成本型的過程。微流控技術的迅速發(fā)展，提高了核酸適配體的篩選效率，從而加速了核酸適配體的發(fā)現(xiàn)，因而將微流控技術和SELEX相結合是研究熱點之一。首先，芯片體積小，在處理少量試劑時，增加篩選的嚴苛性。并能降低試劑與樣品的用量，進而降低篩選成本。其次，在芯片流體通道中，可控制流體流動方式，能較好除去弱結合或未結合的非特異性核酸，大大縮小庫的容量。然后，微流控芯片能夠增大表面積與體積比，進一步增大表面張力，顯著提高分離效率，有效減少篩選輪次，節(jié)約整個篩選時間。再者，芯片更加集成化、自動化，相比于傳統(tǒng)SELEX是另一大優(yōu)勢。Hybarger等[13]在2005年提出了“一個微流控-SELEX原型”，首次將微流控芯片與SELEX相結合，自此微流控SELEX分離技術不斷發(fā)展[14 - 18]。

2.1 基于微珠/磁珠的微流控SELEX

基于微珠/磁珠的微流控SELEX是將靶標分子以共價或非共價方式固定在磁性或非磁性微球表面上。將其通入微流控芯片，形成分離富集區(qū)域。然后在微通道中通入液相寡核苷酸文庫，特異性核酸會與靶標結合。在流體流動情況下，非特異性核酸和弱結合核酸分子被除去。與固定在磁性或非磁性微球表面的靶標特異性結合的核酸分子被洗脫分離后，進行PCR擴展。單鏈化，純化形成新的次級文庫，多輪篩選后進行克隆測序或高通量測序，分析序列信息。為了更加快速、高效和自動化篩選出核酸適配體，Soh等[19]在2009年發(fā)展了一種基于磁珠的微流控SELEX。在微觀尺度上，利用獨特的物理現(xiàn)象，實現(xiàn)了優(yōu)越的篩選效率。僅需一輪篩選，可篩選出針對A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT/A-rLc)特異性結合的核酸適配體，Kd范圍為34～86 nm。同一年，Soh等[20]提出了一個可替代上述分離方法的方法。其采用微磁分離(MMS)芯片，可較好除去未結合的ssDNA，僅需3輪，可篩選出針對鏈霉親和素具有高親和力的特異性核酸適配體，其磁珠回收率高達99.5%，解離常數(shù)范圍為25～65 nmol/L。

Hong等[16]在磁控微流控芯片上構建了一個快速、高效、集成的篩選平臺。精確操控磁珠，在流體流動的狀態(tài)下，將核酸庫與偶聯(lián)在磁球表面的靶標孵育，有效減少弱結合核酸。并通過原位監(jiān)測和實時評估控制整個篩選過程。再結合連續(xù)流沖洗，進一步除去弱結合和未結合的核酸。僅需兩輪，即可篩選出針對腫瘤標志物MUC1蛋白的核酸適配體。此核酸適配體能特異性標記癌細胞，并能進行腫瘤成像，亦可捕獲外泌體，捕獲效率為64%。Hong等[18]優(yōu)化了此篩選平臺，僅需3輪篩選出針對埃博拉病毒(EBOV)的核酸適配體，并成功應用于EBOV的檢測。Lee等[21 - 26]在磁控微流控芯片上，發(fā)展了一種新型自動化篩選平臺，將整個篩選流程集成到一個芯片上。首先將隨機ssDNA文庫通入芯片，進行孵育，特異性核酸與修飾有靶標的磁球結合，弱結合和未結合核酸被除去。特異性核酸在芯片中進行PCR擴增。此集成微流控芯片可連續(xù)且自動地進行多輪SELEX，以篩選針對靶標特異性適配體。此芯片大大減少了孵育和分離時間，大大縮短整個篩選周期。

2.2 毛細管電泳SELEX

Mendonsa and Bowser等[27]提出了基于CE(Capillary Electrophoresis)的核酸適配體篩選程序，即CE-SELEX[28 - 29]。基于CE-SELEX，目前已有核酸適配體相關的應用。已發(fā)展了諸如平衡混合物的平衡毛細管電泳(ECEEM)[30]、平衡混合物的非平衡毛細管電泳(NECEEM)[30 - 31]、Non-SELEX[32 - 34]、微流控自由流電泳(μFFE)[35 - 36]等多種篩選模式。而基于微流控芯片的CE-SELEX：首先，隨機ssDNA庫與特異性靶標孵育，將此混合物注入微流控芯片中。通入高壓直流電場，溶液中未結合的游離核酸、與靶標特異性結合的核酸、與靶標弱結合的核酸根據(jù)遷移能力不同進行電泳分離。與傳統(tǒng)SELEX相比，基于微流控芯片的CE-SELEX大大節(jié)省了實驗時間，大大縮短了實驗周期，將篩選輪數(shù)減少到1～4輪，從而較大提高SELEX的篩選效率。雖然毛細管電泳裝置進樣體積小，一定程度節(jié)約了樣品和試劑，但是由于隨機文庫中有效的目標核酸序列較少，可能存在目標序列缺失的情況，篩選重現(xiàn)性存在差異[37]。而μFFE為CE-SELEX存在的問題，提供了有效的解決辦法。與許多分離方式不同，μFFE可連續(xù)引入、分離和收集樣品[38 - 42]。Bowser等[36]使用μFFE裝置篩選出對人免疫球蛋白E(IgE)的特異性DNA適配體。此裝置在30 min內可注入1.8×1014個序列，與CE-SELEX相比，文庫增大了300倍，一輪選擇后，解離常數(shù)可達nmol/L范圍。μFFE-SELEX無需固定靶標、延長孵育時間或陰性選擇，簡化了篩選流程。亦可把孵育、分離、富集、PCR擴增等集成在一個微流控芯片上，更加集成化，自動化。

2.3 溶膠-凝膠微流控SELEX

溶膠-凝膠微流控SELEX是在微流體芯片中，利用納米多孔溶膠-凝膠液滴微粒來固定抗體、調節(jié)蛋白、膜受體、甚至全細胞等靶標[43 - 45]，增強靶標熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性[45]。隨機文庫與不同靶標競爭性結合，以微加熱方式洗脫核酸，多輪篩選出針對靶標高親和力和高特異性的核酸適配體。Kim等[46]發(fā)展了一種溶膠-凝膠蛋白微陣列，此三維雙納米多孔溶膠-凝膠基質中可容納大量活性蛋白質[47]。并首次將溶膠-凝膠蛋白質陣列用在微流控芯片中，篩選針對多個靶標分子的RNA適配體。此過程可擴展到更大的溶膠-凝膠蛋白陣列，開發(fā)更高通量和更高效的SELEX。Bae等[48]利用沉積在多孔硅芯片上的溶膠-凝膠液滴，捕獲嘌呤代謝物黃嘌呤。靶標不需化學修飾，并用于小分子篩選，僅需7輪篩選可得黃嘌呤的核酸適配體。Ahn等[49]在由5個小室和通道組成的微流控芯片中，用溶膠-凝膠液滴在每個小室內固定酵母TATA結合蛋白及其同源蛋白質，進行核酸適配體的篩選。當RNA隨機文庫通入芯片時，特異性RNA與靶標結合進入溶膠-凝膠液滴內，嚴格洗脫后，分離與靶標結合的核酸，極大地提高了RNA適配體對TATA結合蛋白的篩選效率，篩選周期減少了約80%。Ahn等[50]等又優(yōu)化了溶膠-凝膠復合物的配方，此配方首次用于封裝不溶性小分子雙酚A。首先在多孔硅基底上形成微陣列，核酸適配體與雙酚A產(chǎn)生特異性相互作用，再加熱釋放結合的核酸適配體進行篩選。溶膠-凝膠不需任何修飾，可固定靶標，結合微流控芯片快速分離，可有效提高篩選效率，減少篩選輪數(shù)。

2.4 微陣列SELEX

微陣列可用于SELEX篩選，即微陣列SELEX(Microarray SELEX)。它的優(yōu)勢在于可同時篩選多個靶標，提高了篩選通量，縮短了篩選周期[51]。Collett等[52 - 55]篩選了溶菌酶和和蓖麻毒素的RNA適配體。還將IgE和凝血酶的DNA適配體進行生物素化，并點樣到鏈霉親和素蛋白修飾的微陣列載玻片上，證明核酸適配體對熒光標記的靶標有高特異性和高親和力。Chao等[55]發(fā)展了一種基于微陣列的多種適配體篩選平臺(AD-MAP)?？勺R別靶蛋白上不同位點的親和試劑，大大提高分子檢測的靈敏度和特異性，實現(xiàn)了“雙齒”靶標的試劑識別。Chen等[56]發(fā)展了一種基于微流控的SELMA裝置，可平行地對16種蛋白質進行高通量測定。Liu等[57]基于微流控芯片和蛋白質微陣列發(fā)展了一種有效且快速的SELEX方法。乳鐵蛋白用作靶蛋白，而牛血清白蛋白(BSA)，α-乳清蛋白，β-乳球蛋白和酪蛋白作陰性蛋白，將它們分別點樣并固定，以制備蛋白質微陣列，并將得到的微陣列進一步整合，用于SELEX(PMM-SELEX)過程的微流體芯片中，7輪篩選獲得5種具有高特異性和親和力的適配體(Lac-14，Lac-6a，Lac-9，Lac-3a)。

3 核酸適配體在病毒性疾病的應用

核酸適配體作為“化學抗體”，有著免疫原性和毒性低的優(yōu)勢，可參與病毒蛋白的吸附、入侵、復制、裝配和釋放整個感染周期[58]，在病毒性疾病診斷和治療中具有較大應用潛能。目前，針對人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒(Influenza)、丙型肝炎病毒(HCV)等相關核酸適配體已有相關報道，其他病毒如登革熱病毒(DENV)、埃博拉病毒(EBOV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、SARS病毒、狂犬病毒(RABV)等也有研究，但是病毒適配體庫依舊很小，需要不斷開發(fā)新的病毒適配體。

3.1 流感病毒

甲型流感病毒普遍易感、且呈季節(jié)性，致病性高、死亡率高。并由其抗原變異性，自1889年以來曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的種類分為不同亞型，血凝素由于抗原性是抗體重要的結合位點，也是研究者廣泛研究對象。但是目前針對各亞型的適配體太少，并且缺乏一種能識別一種或多種亞型的適配體。尋找核酸適配體快速診斷流感病毒，并能抑制流感病毒感染具有重要意義。Jeon等[59]篩選出針對H3N2的DNA適配體，并能抑制病毒血凝素和病毒體外感染的能力。Kwon等[60]篩選出的RNA適配體通過中和流感病毒HA的受體結合位點，來抑制病毒與宿主細胞的附著，從而抑制病毒感染。因此可將適配體開發(fā)為抗流感病毒的試劑用于疾病診斷與治療。Nguyen等[61]篩選的適配體IF10和IF22可同時結合H5N1全病毒，并且結合位點不同。同時構建了用于檢測H5Nx全病毒的夾心型SPR生物傳感器，可快速、準確地檢測來自H5N1感染的糞便樣品的全病毒。Wang等[62]發(fā)展了一種高集成的微流控系統(tǒng)。使用一個通用適配體，可區(qū)分三種不同的流感病毒(H1N1、H3N2和乙型流感)，為快速診斷流感病毒提供了新方法。Bai等[63]篩選出針對滅活的完整H1N1病毒顆粒的DNA適配體。其截短序列用于酶聯(lián)寡核苷酸吸附實驗(ELONA)，H1N1檢測限(LOD，S/N=3)為0.3 ng/μL。在電化學阻抗(EIS)適配體傳感器中，LOD增大了300倍(0.9 pg/μL)，且選擇性優(yōu)于其他病毒(>100倍)。此適配體傳感器為更安全、更簡單診斷病毒提供新手段。

3.2 人類免疫缺陷病毒

1981年，在美國首次發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，其是造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒。其感染者潛伏期長、死亡率高，目前無特效治療藥物和預防的有效疫苗抑制艾滋病病毒的感染。因而利用核酸適配體快速診斷艾滋病病毒，并能抑制艾滋病感染具有重要意義。Yamamoto等[64]篩選出對Tat蛋白具有強親和力的RNA適配體，可明顯抑制HIV的活性。Kim等[65]篩選了針對人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核衣殼(NC)蛋白的RNA適配體。它可抑制病毒基因組RNA的包裝，有望成為有效的抗HIV治療藥物并用于疾病治療。Faure等[66]證實在nmol范圍內，寡核苷酸(ODN)93del可作為HIV-1聚合酶體外的有效抑制劑。Stefano等[67]發(fā)展了一種基于高親和力DNA適配體定量檢測HIV RT活性的新方法。此方法簡單、靈敏度高，RT和病毒體檢測限分別為≤6 400 個分子(～4×10-8個單位)和100～300個病毒粒子，并在至少104的范圍內是線性的，為病毒的檢測提供了有效的方法。

3.3 肝炎病毒

肝炎病毒是指引起病毒性肝炎的病原體。人類常見的肝炎病毒有甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)等。甲型肝炎感染后患者可獲得持久的免疫力,因而相關研究較少。乙肝疫苗接種是有效控制HBV傳播的必要手段。Zhang等[68]篩選出針對HBV核蛋白(HBc)的適配體Apt.No.28。此適配體可抑制核衣殼的組裝，從而抑制HBV復制。因此可作為一種新型靶向分子，進行靶向治療以及HBV相關疾病的藥物開發(fā)。HCV是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的常見原因，目前尚未獲得批準HCV疫苗，且核酸適配體在此領域處于初始研究階段，開發(fā)HCV有效的診斷與治療試劑仍然是很有必要的。Chen等[69]篩選了特異性結合HCV包膜表面糖蛋白E2的功能性DNA適配體。此適配體ZE2可特異性捕獲和診斷HCV顆粒，亦可抑制E2蛋白與HCV上受體蛋白CD81的結合，從而阻斷HCV感染細胞。Yu等[70]篩選出針對HCV NS5A蛋白質的適配體。適配體NS5A-4和NS5A-5可抑制HCV RNA復制，從而抑制病毒的產(chǎn)生。NS5A的適配體可用于研究病毒復制和組裝的機制，亦作為丙型肝炎的潛在治療劑。Ghanbari等[71]發(fā)展了一種新型電化學適配體傳感器用于HCV超靈敏檢測。制備的適配體傳感器可以準確地檢測人血清樣品中的HCV抗原濃度，為臨床診斷中快速、高靈敏、高選擇性檢測HCV抗原提供了新的途徑。

3.4 其他病毒

Chekin等[72]利用HPV-16 L1蛋白的RNA適配體，發(fā)展了一種檢測HPV的電化學傳感器，檢測限為0.1 ng/mL。Hong等[18]3輪篩選出針對埃博拉病毒的核酸適配體，并成功應用于它的檢測。嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)是新出現(xiàn)的疾病SARS的病原體。Ahn等[73]使用SARS-CoV的N蛋白的高親和力RNA適配體，可高靈敏地檢測濃度低至2 pg/mL的N蛋白。Liang等[74]篩選出針對狂犬病毒的核酸適配體GE54，此適配體可保護小鼠免受RABV攻擊，有望在臨床上用作針對RABV感染的特異性抗病毒治療試劑。

4 結論

病毒性疾病因其高發(fā)病率和死亡率是人類生命健康的重要威脅，高親和力和特異性的核酸適配體為其防控提供了新的手段。微流控芯片因體積小、流體可控、比表面積大、自動化、集成化和高通量的特點，在核酸適配體篩選中能夠減少樣品與試劑的消耗，節(jié)約成本和增加篩選條件的可控性，進而提高篩選效率，為病毒的檢測提供了高性能的親和試劑。病毒性疾病因現(xiàn)存藥物治療方法帶來的抗藥性問題，給其治療帶來了新的挑戰(zhàn)。

核酸適配體通過結合病毒侵染的關鍵位點，能夠為病毒的治療提供新的途徑。目前在微流控芯片中以病毒為對象的核酸適配體篩選存在著篩選通量低，發(fā)展針對多種病毒的同時篩選是微流篩選的一個重要研究方向。同時，篩選出的適配體結合微流控芯片進一步研究其對病毒侵染能力的抑制，也將是未來病毒的防控和治療提供新的解決手段。