氨基酸分析儀在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 100069)

氨基酸(amino acid)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位。目前為止，已發(fā)現(xiàn)300多種天然氨基酸,且均為α-氨基酸，其中為人體所需的氨基酸有22種[1]。不同氨基酸在人體代謝過(guò)程中發(fā)揮著不同的功能，他們共同調(diào)節(jié)生命活動(dòng)、維護(hù)身體的健康。氨基酸的檢測(cè)分析方法分為非衍生化方法和衍生化方法兩類(lèi)。非衍生化方法包括通過(guò)熒光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)進(jìn)行檢測(cè)；衍生化方法則包括使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用( LC-MS)、氨基酸分析儀、高效液相色譜法等進(jìn)行檢測(cè)[2，3]。其中氨基酸分析儀的方法有方便快速，性能良好的特點(diǎn)，能對(duì)組成蛋白質(zhì)和多肽的22種氨基酸組成與含量進(jìn)行分析，是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)研究中必不可少的手段。

1 氨基酸分析儀概述

氨基酸分析儀有近60年的歷史。1958年Spaekman、Moor和Stein 研制出第一臺(tái)采用離子交換樹(shù)脂柱分離和柱后茚三酮衍生法檢測(cè)的自動(dòng)氨基酸分析儀[4]。近年來(lái)，質(zhì)譜、核磁技術(shù)在氨基酸分析法中的引入，提高了氨基酸分析的準(zhǔn)確性。

氨基酸分析儀分為普通的氨基酸分析儀和全自動(dòng)氨基酸分析儀兩種。二者原理一致，但后者更為方便，應(yīng)用較廣。普遍應(yīng)用的有日立L-8900、L-8800、A-330、賽卡姆氨基酸分析儀等[5]。

氨基酸分析儀能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)水解液以及各種游離氨基酸的組分含量進(jìn)行分析，與普通高效液相色譜(HPLC)的原理相似。但氨基酸分析儀加強(qiáng)了氮?dú)獾谋Ｗo(hù)作用，并將洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，改善了惰性管路以及柱溫梯度的控制。

氨基酸分析儀通過(guò)陽(yáng)離子交換柱色譜將結(jié)構(gòu)、分子量、酸堿性、極性不同的氨基酸分開(kāi),并利用不同pH值及離子濃度的緩沖液將氨基酸按順序洗脫。洗脫后的氨基酸在螺旋反應(yīng)管中與另一通路的茚三酮試劑混合，并在溫度115～120 ℃時(shí)發(fā)生顯色反應(yīng)，形成的藍(lán)紫色產(chǎn)物在波長(zhǎng)570 nm處具有最大吸收峰。其中羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色的產(chǎn)物，最大吸收峰在440nm。將顯色后的產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣品進(jìn)行比較，可完成對(duì)氨基酸進(jìn)行定性和定量的測(cè)定[6]。氨基酸分析儀的不足之處有：(1) 測(cè)定時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，主要由于儀器的離子交換樹(shù)脂易壓縮、流動(dòng)相流速的加快與壓力的增加不成正比造成；(2) 分離后的氨基酸在柱后與水合茚三酮衍生劑產(chǎn)生反應(yīng)，造成了柱后擴(kuò)散比較大、峰形變寬、精確值降低，從而導(dǎo)致了分辨率下降；(3) 氨基酸檢測(cè)不夠全面。某些柱后衍生劑(鄰苯二甲醛)，不能與亞氨基反應(yīng)，造成不能檢測(cè)脯氨酸的含量。另外儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜,價(jià)格相對(duì)昂貴[5]。

2 氨基酸分析儀在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

在消化酶的作用下，攝入的蛋白質(zhì)先被分解為低分子的多肽或氨基酸，然后在小腸內(nèi)被吸收。人體通過(guò)不同的氨基酸代謝途徑將攝入的氨基酸整合，再利用這些氨基酸，使體內(nèi)各種氨基酸的含量形成一種穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。通過(guò)氨基酸分析儀檢測(cè)分析人體代謝產(chǎn)物里的氨基酸成分和含量，能輔助醫(yī)生進(jìn)行臨床診斷和幫助治療。

2.1 氨基酸分析儀在疾病診斷中的應(yīng)用

患病時(shí)人體的代謝產(chǎn)物中會(huì)出現(xiàn)某些氨基酸含量的改變。以人體的血液、尿液以及其它生命物質(zhì)為生物樣本，檢測(cè)其中某些氨基酸含量的變化可以幫助醫(yī)生診斷疾病。

2.1.1 以血液中的氨基酸為檢測(cè)樣本

人體的血液中存在多種氨基酸成分，檢測(cè)其含量的變化能夠幫助判斷某種疾病是否發(fā)生，如苯丙酮尿癥。宋彥強(qiáng)[7]等認(rèn)為，測(cè)定兒童血液中各種氨基酸的含量，能提供患者氨基酸代謝情況的判斷依據(jù)，從而診斷患者是否屬于氨基酸代謝障礙人群。在診斷病人是否患有苯丙酮尿癥時(shí)，首先將血液中的苯丙氨酸羥化酶分解，然后使用氨基酸分析儀檢測(cè)苯丙氨酸羥化酶分解產(chǎn)物中的氨基酸組成與含量，這能夠幫助醫(yī)生診斷患者是否患有苯丙酮尿癥。

此外檢測(cè)血液中的氨基酸含量能夠區(qū)分出腸胃炎患者。消化系統(tǒng)疾病通常伴有不同程度的繼發(fā)性氨基酸紊亂。Tadakazu H等[8]檢測(cè)并觀察了患有腸胃炎人群血液中血漿的氨基酸圖譜,發(fā)現(xiàn)腸胃炎患者血漿中的組氨酸和色氨酸含量發(fā)生了顯著改變。根據(jù)病人的血漿氨基酸圖譜能夠區(qū)分出腸胃炎患者。因此使用氨基酸分析儀檢測(cè)患者血液中的氨基酸組成與含量，能夠幫助醫(yī)生對(duì)腸胃炎進(jìn)行診斷。

2.1.2 以尿液中的氨基酸為檢測(cè)樣本

使用氨基酸分析儀檢測(cè)患者尿液中的氨基酸含量，是臨床上一種常用輔助診斷胃癌的方法。尿液是人體循環(huán)系統(tǒng)的重要成分，尿液中的氨基酸含量會(huì)在人體發(fā)生病變時(shí)出現(xiàn)異常。樊靜等[9，10]檢測(cè)胃癌患者尿液的游離氨基酸代謝狀況，通過(guò)將胃癌組和正常對(duì)照組的尿液中游離氨基酸進(jìn)行比較，篩選出了具有診斷意義的氨基酸。研究者收集胃癌患者與健康成人的晨尿，并使用氨基酸分析儀檢測(cè)樣本中各種游離氨基酸的含量。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組患者尿液中的纈氨酸、精氨酸與異亮氨酸相對(duì)含量升高且與對(duì)照組具有明顯差異，而天冬氨酸、組氨酸的相對(duì)含量降低。通過(guò)采集患者尿液進(jìn)行氨基酸含量情況的檢測(cè)，診斷胃癌效果較好，并且效率較高。

2.1.3 以其它生命物質(zhì)中的氨基酸為檢測(cè)樣本

氨基酸分析儀也被用于檢測(cè)人乳、精液等其它人體生命物質(zhì)中的氨基酸。人乳中的氨基酸對(duì)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用，并且可以升高嬰幼兒的抗體含量、提高免疫力和對(duì)嬰幼兒的腸道進(jìn)行保護(hù)。利用氨基酸分析儀，研究人乳中有效成分對(duì)嬰幼兒的疾病診療也起到至關(guān)重要的作用[11]。人乳的氨基酸組成與含量在很多國(guó)家已經(jīng)被用來(lái)輔助診斷嬰幼兒的疾病, 并且建立了相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)。

對(duì)精液進(jìn)行氨基酸分析被用于輔助診斷人類(lèi)生殖性疾病。Masatoki Katayama等[12]評(píng)估了人類(lèi)精液中40種氨基酸與精子運(yùn)動(dòng)性及形態(tài)的關(guān)系。精漿中的氨基酸含量與血清中的氨基酸含量不同，研究發(fā)現(xiàn)精漿中絲氨酸(Ser)和β-丙氨酸(β-Ala)的水平非常低。研究者將血液與精液的Ser和β-Ala差值進(jìn)行對(duì)比，來(lái)分析精液的濃度，這能幫助診斷精液分泌成分異常或精液減少的相關(guān)疾病。

V型膠原α1(V)鏈的表達(dá)異常為Ehlers- Danlos綜合征的基本特征。研究者利用氨基酸分析儀檢測(cè)該膠原鏈的氨基酸組成以及表達(dá)水平，能夠幫助醫(yī)生提前預(yù)測(cè)并診斷Ehlers-Danlos結(jié)締組織病[13]。

2.2 氨基酸分析儀在患者治療監(jiān)護(hù)中的應(yīng)用

在不同代謝狀態(tài)下人體內(nèi)的氨基酸水平會(huì)發(fā)生變化，這能夠用來(lái)監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展進(jìn)程。如肌肉合成蛋白障礙患者的膠原蛋白合成狀況，苯丙酮尿癥患者的恢復(fù)情況。

膠原蛋白的合成在運(yùn)動(dòng)后升高多達(dá)3天。運(yùn)動(dòng)后，氨基酸可用性增強(qiáng)，混合肌肉蛋白的合成增加。肌肉膠原蛋白的合成需要攝取亮氨酸，Hiroyuki K等[14]運(yùn)用氨基酸分析儀來(lái)檢測(cè)血液中亮氨酸含量、監(jiān)測(cè)肌肉合成蛋白障礙患者的膠原蛋白合成量，能夠幫助醫(yī)生及輔助檢查的醫(yī)技人員得知患者肌肉的合成蛋白狀況。

另外用氨基酸分析儀可以對(duì)苯丙酮尿癥患者的治療進(jìn)行監(jiān)護(hù)。定期和準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)血液中苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)水平是成功治療管理苯丙酮尿癥(PKU)患者的先決條件。通過(guò)收集患者靜脈血樣進(jìn)行氨基酸含量的分析[15]，讓醫(yī)生能夠得知PKU患者的恢復(fù)情況，從而更加有針對(duì)性的對(duì)PKU患者進(jìn)行監(jiān)控與康復(fù)治療。

氨基酸類(lèi)的注射液常用于提供患者外源性營(yíng)養(yǎng)，有利于疾病的康復(fù)與治療，但可能出現(xiàn)不良反應(yīng)。鄭斌等[16]利用氨基酸分析技術(shù)，對(duì)藥品中的氨基酸配比與含量進(jìn)行分析，能夠幫助醫(yī)生發(fā)現(xiàn)引起患者不良反應(yīng)的氨基酸，及時(shí)緩解患者不適。

2.3 氨基酸分析儀在疾病治療中的應(yīng)用

測(cè)試了解乳腺癌患者、血液透析患者康復(fù)時(shí)的氨基酸水平，能夠?qū)颊叩闹委熖峁┲笇?dǎo)。

高翠紅等[17]采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)55例乳腺癌患者及50例正常人血漿、尿液中游離氨基酸的含量。由于乳腺癌患者體內(nèi)存在氨基酸代謝紊亂，研究發(fā)現(xiàn)患者血漿中蛋氨酸的含量較正常人顯著地升高，異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸較正常人顯著地降低，支鏈氨基酸/芳香族氨基酸比值較正常人顯著地下降。然后他們對(duì)乳腺癌患者實(shí)施了“不平衡氨基酸療法”——補(bǔ)充支鏈氨基酸和精氨酸等氨基酸。證明了對(duì)于乳腺癌患者來(lái)說(shuō)，補(bǔ)充支鏈氨基酸和精氨酸等是一種便捷可靠的治療方法。

測(cè)定血液透析患者的氨基酸譜，能夠明確患者體內(nèi)的氨基酸含量與組成，幫助醫(yī)生了解患者的營(yíng)養(yǎng)狀況，同時(shí)對(duì)透析患者的營(yíng)養(yǎng)狀況進(jìn)行評(píng)估。因此測(cè)定血液透析患者的氨基酸譜，對(duì)血液透析患者的臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。血液透析患者在長(zhǎng)時(shí)間的透析過(guò)程中，處于營(yíng)養(yǎng)消耗狀態(tài)并且可能發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良。與正常人群相比，此類(lèi)患者氨基酸的代謝存在差異，主要表現(xiàn)在骨骼肌的蛋白質(zhì)的分解代謝增加明顯高于合成代謝增加，分解代謝大于合成代謝，導(dǎo)致負(fù)氮平衡。杜娟等[18]利用氨基酸分析儀檢測(cè)患者的血漿氨基酸水平變化，在分析患者氨基酸失衡的原因后，依照相關(guān)指標(biāo)制定了此類(lèi)患者營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的評(píng)價(jià)指標(biāo)及管理對(duì)策。通過(guò)研究證明，補(bǔ)充氨基酸能夠治療改善透析患者的營(yíng)養(yǎng)不良。

此外，補(bǔ)充必需氨基酸對(duì)于改善老年冠狀動(dòng)脈疾病后遺癥患者的抑郁癥狀、營(yíng)養(yǎng)狀況、肌肉功能、日常身體活動(dòng)和生活質(zhì)量有明顯的功效。Mariangela R等[19]使用氨基酸分析法研究評(píng)價(jià)了補(bǔ)充必需氨基酸前后的營(yíng)養(yǎng)狀況，與安慰劑組相比，補(bǔ)充必需氨基酸之后患者的微型營(yíng)養(yǎng)評(píng)分發(fā)生了提高。這證明了口服補(bǔ)充必需氨基酸能夠改善了老年患者的營(yíng)養(yǎng)與代謝狀況，改善了患者抑郁、肌張力下降的癥狀。

2.4 氨基酸分析儀在醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中的應(yīng)用

氨基酸分析法被用于分析原發(fā)性肝癌患者與正常人在氨基酸水平上的差異，從而對(duì)疾病的診斷或治療提供了新思路。

2.4.1 在疾病研究中的應(yīng)用

肝臟和腎臟是體內(nèi)氨基酸代謝的兩個(gè)主要場(chǎng)所，因此血漿中氨基酸譜的改變與肝臟的功能有著密切的關(guān)系。血液中的芳香族氨基酸所占比例會(huì)在患有肝衰竭的患者中增加，并且當(dāng)患者的肝臟受損程度不同時(shí)，其血漿氨基酸譜的改變程度呈現(xiàn)出的分布不同。趙玉萍等[20]使用氨基酸分析儀對(duì)原發(fā)性肝癌患者血漿中微量元素與氨基酸濃度的變化進(jìn)行了研究。研究者采集并檢測(cè)了受檢者血漿樣本，對(duì)比正常人群發(fā)現(xiàn)肝癌患者血漿中必需氨基酸：纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)濃度明顯下降，這提示當(dāng)發(fā)生肝癌時(shí)，患者常伴有高胰島素血癥。肝癌患者血漿中能夠抑制癌細(xì)胞增殖的精氨酸(Arg)，其濃度比正常人組顯著降低，因此臨床中通過(guò)適當(dāng)補(bǔ)充Arg能夠改善肝癌患者的預(yù)后。

肺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也伴隨著氨基酸和元素水平的變化。王纓等[21]對(duì)肺癌、癌旁組織、血清中的氨基酸和元素的含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)對(duì)比證實(shí)了氨基酸含量的分析能夠幫助醫(yī)生進(jìn)行肺癌的臨床診斷和治療。研究中將肺癌患者血清和健康人血清中得氨基酸含量進(jìn)行比較和分析，發(fā)現(xiàn)肺癌組織中的賴氨酸(Lys)含量明顯高于癌旁組織，且肺癌患者血清中的賴氨酸含量較正常人血清也出現(xiàn)增高。此研究結(jié)果應(yīng)用到肺癌檢測(cè)中，能夠輔助肺癌的診斷。

腎癌患者的血清中氨基酸水平與正常人組相比，也發(fā)生了顯著的改變。Aladdin M等[22]測(cè)定了189名腎癌患者和104名正常人血清中26種不同氨基酸的濃度。研究發(fā)現(xiàn)15種氨基酸在患者體內(nèi)出現(xiàn)了顯著性變化，例如半胱氨酸、鳥(niǎo)氨酸、組氨酸、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、纈氨酸和賴氨酸等氨基酸。該研究表明，血清的氨基酸水平能夠作為一種篩選工具，能幫助對(duì)腎癌患者的診斷。

阿爾茲海默癥也會(huì)造成患者體內(nèi)的氨基酸組成發(fā)生變化，患者體內(nèi)氨基酸代謝紊亂或障礙。劉秀勤等[23]采用病例-對(duì)照研究，收集了34位阿爾茨海默病患者與31位健康老年人尿液樣品，測(cè)定了尿液中17種游離氨基酸的含量。病例組和對(duì)照組中的尿液中賴氨酸(Lys)、纈氨酸(Val)、蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)含量有顯著性差異，谷氨酸(Glu)的水平與對(duì)照組相比分別降低了31 %。 此外George G.等[24]分離出與阿爾茨海默病相關(guān)的腦血管蛋白，并通過(guò)氨基酸分析儀研究了這種蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果顯示該蛋白可以衍生自獨(dú)特的血清前體，從而研制出了檢測(cè)阿爾茲海默病的新方法。

為探討甲硫氨酸在誘導(dǎo)高同型半胱氨酸(Hcy)血癥過(guò)程中的抗氧化作用，孟斌等[25]將大鼠隨機(jī)分為正常組和1%甲硫氨酸組，喂養(yǎng)6周后，其中用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定了血清中甲硫氨酸和牛磺酸含量。研究表明甲硫氨酸在誘導(dǎo)高半胱氨酸血癥的過(guò)程中具有抗氧化作用。

2.4.2 在疾病預(yù)防研究中的應(yīng)用

人體腸道內(nèi)的多種菌群，它們分布需要不同的營(yíng)養(yǎng)。通過(guò)考察不同氨基酸含量的培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，為獲得更高效的菌群提供了新的思路。乳桿菌屬和雙歧桿菌菌株需在含有谷氨酸單鈉(MSG)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。E Barrett等[26]考察研究了在不同氨基酸含量的培養(yǎng)基條件下，細(xì)菌的生長(zhǎng)和MSG向氨基丁酸(GABA)的轉(zhuǎn)化情況。該研究通過(guò)這種對(duì)腸道微生物菌群的特定培養(yǎng)，找到了最佳的MSG向GABA的轉(zhuǎn)化條件，這樣獲得更加高效的菌群，為通過(guò)微生物菌群得調(diào)節(jié)來(lái)預(yù)防多種腸道疾病的發(fā)生、預(yù)防胃腸道疾病提供了新的前景。

此外應(yīng)用氨基酸分析發(fā)現(xiàn)了對(duì)胰島素起到明顯作用的氨基酸。乳清蛋白可增加餐后血清胰島素水平。Albert Salehi等[27]經(jīng)過(guò)研究并通過(guò)氨基酸分析法，發(fā)現(xiàn)胰島素水平的降低與亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和促胰島素多肽(GIP)的血清水平升高相關(guān)。明確了對(duì)胰島素起到明顯作用的氨基酸，這為胰島素相關(guān)的疾病開(kāi)辟了新的治療研究領(lǐng)域 。

2.4.3 在其它醫(yī)學(xué)研究的應(yīng)用

氨基酸分析儀還聯(lián)合用于研究蛋白質(zhì)的表達(dá)及其在生物學(xué)影響下的變化，為生物材料的研究開(kāi)發(fā)提供了新方法。Pingmei Yan等[28]將聚丙烯酰胺凝膠電泳與氨基酸分析法結(jié)合使用，定性和定量地表征了膠原蛋白的氨基酸組成。運(yùn)用氨基酸分析儀Takako Naito等[29]闡述了胰島素和氨基酸對(duì)肝臟和肌肉中雷帕霉素靶蛋白(mTORC1)自噬途徑的差異。

氨基酸分析儀是一種常用的檢測(cè)氨基酸含量與組成的儀器，使用起來(lái)較為簡(jiǎn)便快捷。它既可以單獨(dú)使用，也可以與其它儀器聯(lián)合使用。Hannelore K等[30]將氨基酸分析儀與質(zhì)譜等氨基酸檢驗(yàn)的重要儀器聯(lián)用，發(fā)揮了各儀器的優(yōu)點(diǎn)，使研究更加高效準(zhǔn)確。綜上所述，氨基酸分析儀的使用能夠輔助醫(yī)生對(duì)疾病進(jìn)行臨床診斷、幫助醫(yī)生對(duì)患者的疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)能夠?qū)εR床的治療提供指導(dǎo)作用。它在疾病的治療研究中也不斷地發(fā)揮著重要作用，推動(dòng)著臨床醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)研究不斷地發(fā)展和進(jìn)步。隨著氨基酸分析儀的分析速度、靈敏度和重復(fù)性的提高，氨基酸分析儀將成為一種醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中更為有效的工具[31]。