懸浮固化液相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用測(cè)定水樣中甲硝唑和氯霉素

(1.浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院 杭州 310015；2.杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院理工分院 杭州 310018)

自1959年甲硝唑(metronidazole)被合成出來(lái)后，起初是治療滴蟲(chóng)病的首選藥物，其后又發(fā)現(xiàn)可抑制阿米巴原蟲(chóng)氧化還原反應(yīng)，使原蟲(chóng)氮鏈發(fā)生斷裂，具有抗菌和消炎的作用[1]，現(xiàn)在已是臨床常用的硝基咪唑類抗微生物藥物[2]。氯霉素是一種廣譜抗生素，由于價(jià)廉及優(yōu)良的抗菌性和穩(wěn)定的藥效常用于動(dòng)物的各種傳染病的治療中。但是，氯霉素有嚴(yán)重毒副作用，水中氯霉素殘留不僅對(duì)動(dòng)物和人體有直接危害，而且還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性，易引起人體血中毒，導(dǎo)致不可逆的再生障礙性貧血，對(duì)人體健康構(gòu)成巨大的威脅[3]。甲硝唑則存在致遺傳變異和致癌性等毒副作用[4]。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)獸藥的濫用，以及人民生活水平的提高，各種個(gè)人護(hù)理用品的廣泛使用，導(dǎo)致目前水中甲硝唑、氯霉素等殘留污染越來(lái)越嚴(yán)重[5]。甲硝唑和氯霉素的測(cè)定有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等[6，7]。在測(cè)定過(guò)程中，樣品前處理所占時(shí)間約占整個(gè)測(cè)定環(huán)節(jié)的61%。傳統(tǒng)的樣品前處理存在操作繁瑣，需要使用大量對(duì)人體和環(huán)境有害的有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)。針對(duì)這一問(wèn)題，近年來(lái)，已經(jīng)發(fā)展了多種微萃取技術(shù)，如固相微萃取、液相微萃取、膜萃取等[8]。懸浮固化液相微萃取技術(shù)( solidification of floating organic drop with liquid phase microextraction, SFO-LPME)自2007年提出后[9],因其具有集樣品采集、萃取、濃縮于一體功能,而且操作簡(jiǎn)單、成本低、富集倍率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種環(huán)境友好型樣品前處理新技術(shù)，可與HPLC、GC、AAS等儀器聯(lián)用，在環(huán)境污染、藥物代謝、農(nóng)藥殘留、重金屬測(cè)定等痕量分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。在樣品溶液中加入幾十微升有機(jī)溶劑，分散混勻后，萃取溶劑可直接進(jìn)樣分析。微萃取法集采樣、萃取和濃縮于一體，操作簡(jiǎn)單、快速、成本低、對(duì)環(huán)境友好且富集效率高[11]。本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜法，以甲硝唑、氯霉素為研究目標(biāo)，建立了以懸浮固化液相微萃取技術(shù)對(duì)水樣中甲硝唑、氯霉素含量的測(cè)定方法，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于測(cè)定水樣中甲硝唑和氯霉素。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

P230II高效液相色譜儀，包括UV230II紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、P230II高壓恒流泵、LU230II低壓梯度混合器(大連依利特分析儀器有限公司)；AB204-N電子分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)；07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)；KQ-300GVDV型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GM-0.33A隔膜真空泵(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；UPWS超純水器(杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司)。

甲硝唑、氯霉素(純度≥99%，購(gòu)至阿拉丁)；磷酸為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇為一級(jí)色譜純(天津四友)；水為超純水，正十一醇、正十二醇(上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2 水樣懸浮固化液相微萃取方法

取20mL水樣加入100mL小燒杯中加入0.49 g十二醇，在一定溫度、pH、攪拌速度下攪拌10min，然后冰浴5min取出上浮物，融化上浮物，進(jìn)行濾膜過(guò)濾，即得液相色譜進(jìn)樣溶液。

2 方法

2.1 模擬水樣的制備

精確稱取甲硝唑和氯霉素適量，加水制成10μg/mL甲硝唑、20μg/mL氯霉素混合溶液，搖勻，即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的制備

稱取甲硝唑和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配置成1mg/mL貯備液，4℃貯存，用前逐級(jí)稀釋。

2.3 色譜條件

色譜柱：WondaCract ODS-2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司公司)；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液∶甲醇(80∶20)；流速：1mL/min；柱溫：45℃；波長(zhǎng)：280nm。該色譜條件下，果糖與葡萄糖的色譜峰完全達(dá)到基線分離(R>2)。

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

在2.3色譜條件下，將配制好的10、20、50、80、100μg/mL的甲硝唑和50、80、100、200、400μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別用所建方法進(jìn)行測(cè)定，以甲硝唑，氯霉素的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X,μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性繪制，得到甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=16.83x-5.869，r=0.995；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=16.86x+134.7，r=0.997。并根據(jù)信噪比(S/N)=3計(jì)算出方法檢出限，結(jié)果見(jiàn)表1，對(duì)照品與水樣的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 甲硝唑和氯霉素的線性方程、相關(guān)系數(shù)以及檢出限

圖1 對(duì)照品與水樣的HPLC色譜圖1.甲硝唑 2.氯霉素

3.2 精密度試驗(yàn)

取50μg/mL的甲硝唑、氯霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行5次含量測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。結(jié)果表明，該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

表2 甲硝唑精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 氯霉素精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取50μg/mL、100μg/mL的甲硝唑和氯霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按2.3項(xiàng)下色譜條件下分別在0、2、4、6、8h下進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。結(jié)果表明，該方法具有良好的穩(wěn)定性。

表4 甲硝唑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表5 氯霉素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 加樣回收率試驗(yàn)

取10mL的濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的甲硝唑溶液和10mL的濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的氯霉素溶液按2.1項(xiàng)制備進(jìn)樣溶液后按2.3項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，用峰面積換算十二醇中的試樣含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

表6 甲硝唑回收試驗(yàn)結(jié)果

表7 氯霉素回收試驗(yàn)結(jié)果

3.5 萃取條件優(yōu)化

盧巧梅等人[12]在采用懸浮固化液相微萃取對(duì)食品中的兩種生長(zhǎng)素進(jìn)行方法優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)萃取溫度A、十二醇用量B、鹽濃度C、pH值D、攪拌速度E等因素對(duì)體系的萃取效果都有相互影響。因此，本實(shí)驗(yàn)在參考該文的萃取條件，采用5因素4平行正交試驗(yàn)(表8、表9)。

表8 因素水平表

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果

表10、11的極差分析中，極差越大表明該因素對(duì)結(jié)果的影響越顯著。試驗(yàn)表明pH值對(duì)水中甲硝唑的萃取效果的影響最大，然后依次是攪拌速度、NaCl濃度、提取溫度，影響最小的是十二醇的用量。攪拌速度對(duì)水中氯霉素的萃取效果的影響最大，然后依次是pH值、NaCl濃度、十二醇用量，影響最小的是溫度。甲硝唑的最佳提取條件是溫度30℃，十二醇用量為0.49g，NaCl濃度為0.1g/ml，pH為7，攪拌速度為1200r/min。氯霉素的最佳提取條件是溫度60℃，十二醇用量為0.49g，NaCl濃度為0.3g/mL，pH為5，攪拌速度為1200r/min。

表10 甲硝唑正交試驗(yàn)極差分析

表11 氯霉素正交試驗(yàn)極差分析

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)水樣中的甲硝唑和氯霉素建立了微萃取測(cè)定方法。得到了較佳的測(cè)定色譜條件為：WondaCract ODS-2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司公司)；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液∶甲醇(80:20)；流速：1mL/min；柱溫：45℃；波長(zhǎng)：280nm。本方法前處理較為簡(jiǎn)便，測(cè)定準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可作為后續(xù)研究水中甲硝唑和氯霉素的常規(guī)測(cè)定方法。